一些分子生物學實驗小技術1

1．保存菌種

保存菌種或長時間放置的培養板應先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質粒則應加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時，按0.1%-0.5% 比例轉種，培養基的量不應超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測菌密度時，讀數值在0.1-0.5 范圍內為線性相關，超過該范圍的應作稀釋。通常１升的過夜培養12-16h，濕重為3 g左右，密度往往是3-4 ′109 個細胞／每毫升培養物離心收菌后可在-20攝氏度凍存數周。

2．T 法快速轉化大腸桿菌
A．過夜培養物轉種后27拚２度快搖約205hrs至O.D 值為0.3 左右。

B．取１ml菌液離心收菌，加入0.1ml 冰浴的1 ′T 液輕輕吸打懸起細胞。（可以放-70 攝氏度凍存半年）B 、可以取0.1ml 菌液加入0.1ml 冰浴的2 ′T 混勻，該方法只適于做質粒轉化，如做連接產物轉化請按２Ａ做。

C．加100pg-10ngDNA 混勻。冰浴10min ，室溫放置10分鐘再次冰浴10mi.

D．加1ml LB，37攝氏度1 小時。

E．涂板。轉化效率106-108 對于DH52，Ｃ600 ，等轉化效率在107-108 以上）。 快速鑒定插入外源片段的克隆
3．快速鑒定插入外源片段的克隆（從轉化子中篩選重組名）

由于載體自身環化會產生大量的不含插入片段的轉化子，給鑒定重組子帶來一些麻煩。通常用雙酶切（即插入片段兩端酶切位點不同）載體去磷酸化，或者藍白斑篩選有助于減少這種麻煩，但有的時候還是會需要大量篩選轉化子中的重組子。

A．Epicertre 公司提供一種快速連接和篩選試劑盒。可在轉化子分布不是太密時（較低的鋪板密度）待菌長到較大時，用滅菌牙簽沾很少量菌點板（轉到新的篩選平板上以便給菌落編號），將剩下的菌全部挑起轉至已加入快速篩選試劑的eerdorf管中，混句，補加試劑2 后即可準備上樣跑電泳，鑒定是否插入外源片段。

B．轉化子密度很高時可用滅菌牙薟沾取菌落，點板編號后插入含1mlLB （含抗生素）的小試管中，加蓋，37攝氏度快搖3-5hrs至LB渾濁（肉眼觀察很明顯長菌），轉至eerdorf 管中離心收菌，去上清。加入15ml含RNAse A 和溴酚藍（溴酚藍也可以最后上樣再加）的ＴＥ，振蕩以充分懸浮細胞，加入15ml酚一氯仿劇烈振蕩5-10秒，離心，取上清即可上樣電泳。注意這時電泳槽中buffer的量應比膠面高2mm ，上樣時要小心，避免上清的擴散。膠不宜太厚。如果細菌太多加酚后振蕩應為液狀，如成固體狀就是太多菌了）則要相應增加ＴＥ和酚氯仿量。另外，我們推薦CＬＰ公司或Ａ、Ｂ公司的電泳槽，這種電泳槽的承膠底座是透紫外的，當制膠時加入ＥＢ即可在電泳的過程中觀察電泳情況。在大量篩選時往往要同時跑很多的樣品，制較大的膠，在ＤＮＡ量較少的情況下往往需用短波下紫外觀察以便得到更清楚的結果。用這種電泳板即可直接把承膠底座連膠一起放在下紫外燈上（或凝膠成像系統中），不需要將膠推下來或倒置。在需要時即可繼續電泳。

4．當找到可能的重組質粒且條帶清晰時可直接切下含DNA 的凝膠條帶，用膠回收DNA 的方法回收質粒并進行酶切鑒定，如果DNA 量太少則需重提質粒。 用QIAprep Miniprep in 小量提質粒注意以下事項可提高得率
A．用含抗生素的培養基培養細菌會有較高的得率。
B．收菌時用ti吸干凈殘余的培養基上清。
C．加入Ｐ１后應充分振蕩以完全打散懸浮細胞，特別是多次離心收菌的情況下較難打散細菌，可用ti 反復吸打因為殘留的小塊菌團會嚴重影響得率和DNA 的質量。

D．加入Ｐ２后立即輕輕搖勻，可反復倒轉eerdorf 管4-6 次充分混勻菌數較多時可靜置不超過5 分鐘，以便充分裂解提高得率，超過5 分鐘的會降低質粒質量。甚至可能出現部分質粒不可逆的變性的情況，可能在電泳時得到一條酶切不動的質粒條帶。

E．加入Ｎ３后立即輕輕混勻，可反復倒轉eerdorf 管5-7 次以充分混勻。菌數較多時可靜置幾分鐘以便質粒充分復性。
F．離心后上清液上柱，注意不要將懸浮的細胞碎片（如果有的話）加入柱中，如已在柱中請吸出。我們建議一定用洗柱，特別是菌數較多，或菌株糖蛋白較多的情況，以保證DNA 的質量。
G．對于較大的質粒，（<10Kb ），請70攝氏度預熱、洗脫buffer或ddH2O 以提高得率，對于拷貝數不高的情況可以用50ml洗脫buffer或ddH2O 分別洗2 次，如果拷貝數高的可用100ml.靜置1 分鐘后再離心，有助提高得率，buffer或H2O 應加在膜中央而非管壁上。