人淋巴細胞的培養

人淋巴細胞的培養

1.實驗目的

（1）能獨立地進行用于細胞培養的個中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。

（2）熟練掌握RPMI 1640培養基的配制方法。

（3）熟練掌握細胞傳代培養的操作方法。

（4）觀察外培細胞在不同時期的形態變化及生長狀況。

（5）掌握死活細胞的鑒別原理及方法。

實驗原理：

（1）傳代培養是組織培養常規保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續生長。這一過程就叫傳代。傳代培養可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作

（2）清洗與消毒是組織培養實驗的*步，是組織培養中工作量zui大，也是zui基本的步驟。體外培養細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌操作的要求程度很高。細胞培養不好與清洗不徹底有很大關系。

（3）滅菌手段的選擇也十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養價值、生物學特性或其他使用價值也不行。

（4）細胞培養使用的培養基一般是由合成培養基和小牛血清配制而成。合成培養基有商品出售，它是根據細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質。它的酸堿度和滲透壓與活體內細胞外液相似。小牛血清含有一定的營養成分，更重要的是它含有細胞生長所必需的生長因子；酶、微量元素和激素；保護作用；提供伸展和貼附因子等，是合成培養基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質（重金屬、抗菌素）的毒性。 

（5）氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養基提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養液內。

（6）懸浮型細胞培養常見于淋巴細胞、白血病細胞、骨髓瘤細胞和腹水型惡性細胞等的培養。懸浮型細胞傳代培養的zui大特點是原代細胞不必經過機械分離或消化酶消化處理，傳代時只須把培養的懸浮細胞做適度稀釋或把培養細胞經簡單的離心處理后再加入適量的培養液即可培養。因此，細胞在從原代到傳代的轉變過程中遭受的機械損傷和化學損傷的可能性較少，損傷程度也較輕，相對而言，傳代的成功率較高。但由于這類細胞或細胞集體可懸浮在液體培養基中，而不附著在固體表面上，因此無論原代培養或傳代培養的細胞增殖過程都沒有貼附性細胞那種明顯可辨的3個變化階段，其培養的可見效果是細胞數目的增多及溶液中細胞濃度和密度的加大。

（7）細胞的存活率是反映細胞群體生活狀態的重要指標。多種方法可以鑒別細胞的死活，zui常用到的方法是染色排除法。由于許多酸性物質不易穿過活細胞的質膜進入胞內，卻能滲入死亡的細胞內，使其著色，以此來區別死活細胞。

實驗設備及材料

（一）儀器：

超凈工作臺、干燥箱、過濾器、高壓滅菌鍋、多重蒸餾水器、磁力攪拌器、天平、微量加樣器（移液槍）、倒置顯微鏡、超低溫冰箱、二氧化碳培養箱、顯微鏡、血球計數板

（二）材料：

微孔濾膜（直徑25mm，孔徑為0.22um）、細胞培養瓶、玻璃棒、量筒、研缽、燒杯、漏斗、濾紙 、pH試紙、微孔過濾器（0.22μm）及注射器、各種規格的Tip 、離心管 、細胞培養瓶、滴管、人類淋巴細胞株

（三）試劑：

75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH、 HCl、1%酚紅 、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、鏈霉素 、飽和NaHCO3 、L-谷氨酰胺 、三蒸水、乙醇、0.4%臺盼藍溶液（生理鹽水配制）