人胃癌裸鼠原位種植轉移模型建立—細胞懸液原位種植法

人胃癌細胞懸殊液接種于裸鼠皮下，形成穩定傳代的皮下移植瘤，將皮下移植瘤組織再接種于裸鼠胃漿膜下，稱為間接胃原位移植模型，并與直接用細胞懸液接種于裸鼠胃漿膜下、皮下、腹腔、尾靜脈的移植瘤模型比較，觀察移植腫瘤的生長狀況、移植成功率和自發轉移的發生率及組織學變化及細胞動力學改變等生物學特性。

BLAB C-nu nu小鼠GC9811細胞

水飼料乙醇甲醛液氮石蠟

超凈層流架手術刀絲線荷包冰箱光學顯微鏡流式細胞儀

一、實驗材料準備

BLAB/C-nu/nu小鼠，鼠齡3-5 wk，雌雄兼用，其實驗和飼養均在SPF條件下的超凈層流架中進行，滅菌水和飼料供動物自由攝入。GC9811常規傳代。

二、

1.  收集體外培養的對數生長期的GC9811細胞，調節細胞數為1×10¹⁰L^-1，每只裸鼠取0.2 mL注入右大腿背側皮下，當皮下移植瘤長至直徑為1.5 cm左右時取出移植瘤，瘤組織用鋒利的小刀切成約0.1 cm直徑的小塊，選擇已禁食12 h的10只裸鼠，術前用乙醚吸入麻醉。

2.  常規消毒皮膚，選擇左側正中旁切口，打開腹腔將胃拉出，用5.0絲線對胃大彎側前壁漿膜層做荷包縫合（直徑約 cm）用小手術刀細心劃傷荷包中心胃壁漿膜層，然后將預先切好的3-4塊瘤組織包埋入囊內，扎緊荷包縫線，縫合腹膜（含肌層）及皮膚。

3.  當裸鼠處于瀕死狀態時，將其中1只用頸椎脫位術處死， 取出移植瘤，一部分瘤組織以原代移植方法行鼠間連續原位傳代（每次傳代5-10只裸鼠），按上述方法收集細胞、打開裸小鼠腹腔，于裸鼠胃竇大彎側中部的胃壁漿膜下注射GC9811 細胞懸液0.2 mL，并可見漿膜下鼓起一透亮小泡為標志，停留數秒鐘后抽出針頭，并用750 mol L^-1乙醇棉球擦拭注射部位及其附近的胃漿膜面，以殺死溢流出來的瘤細胞。

4.  將胃送回腹腔并用4.0號手術縫線縫合腹壁肌層及皮膚。

5.  同前收集細胞懸液，腹腔移植瘤模型的裸鼠與尾靜脈移植瘤模型的裸鼠分別于腹腔內、尾靜脈各注入GC9811 細胞懸液0.2 mL，皮下移植瘤模型的建立同前。

6.  移植后的裸鼠分組分籠于SPF條件下飼養，逐日觀察，待荷瘤裸飼養至瀕死狀態或自然死亡，解剖觀察，記錄腫瘤侵潤和轉移情況，對移植瘤和接種瘤分別觀察并測量瘤體的長（L）、寬（W）、高（H），用公式V=π/6（L×W×H）計算其體積。

7.  標本經40 gL_^-1的中性甲醛固定，常規石蠟切片，光鏡檢查。

8.  余下瘤組織液氮凍存備用。

9.  裸鼠處死前，采用摘眼球方法采集血液，及時分離血清檢測或-200℃冰凍保存待測，以正常裸鼠血清為對照，用放免分析法檢測血清中CEA的含量。

10.  制備單細胞懸液，調整細胞密度至1×10¹⁰L^-1，4℃，750 mol L^-1乙醇固定，染色，流式細胞儀測定。

11.  采用Barlogie細胞同期分析法，將處于不同時期的細胞分為G1，S，G2期細胞。

12.  以正常組織對照按公式（DI=腫瘤組織G1峰值/正常組織G1峰值）計算DNA指數。

13.  實驗數據用x±s 表示，采用t檢驗檢測各組之間的差別。

14.  移植的腫瘤在原位均有生長，術后3 wk左右于裸鼠上腹部可捫及直徑約2-3 mm質地較硬的結節，6-7 wk 時上腹部可捫及較明顯的腫塊，動物衰竭明顯，荷瘤鼠生存時間6-9（平均7.5）wk。 移植瘤呈結節狀，質地較硬，大小為0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm-2.6 cm×1.8 cm×1.9 cm，病理證實癌細胞侵襲胃壁固有肌層及胃腔表面粘膜層，肝內轉移，淋巴結轉移。

采用人胃癌細胞系GC9811裸鼠皮下移植瘤組織塊為材料，原位移植于裸鼠胃壁，成功建立了人胃癌皮下-胃原位移植轉移模型，瘤率100%，肝臟轉移率較瘤細胞懸液法原位移植模型明顯增加。 所有模型未見肺臟轉移，而尾靜脈注射瘤細胞后僅見肝臟轉移，可能為GC9811本身不具備肺臟轉移的生物學特性。 裸鼠器官微環境的不同，表現出移植瘤轉移率存在顯著差異。裸鼠的原位移植頗似臨床患者的轉移特點，且轉移率高，更客觀地模擬了胃癌患者的體內侵襲和轉移特性。 除在組織學、倍性分析上與胃癌低分化腺癌一致，保持了產生CEA 的功能，是一個生物學特征較穩定的人胃癌裸鼠皮下—胃原位移植轉移模型。胃癌在我國居惡性腫瘤之首，晚期預后差，長期存活率較低，迫切需要建立探究胃癌機制的模型。