我做了穩定轉染，從G418濃度確定到最后的單克隆化鑒定。有自己的體會也有其他戰友遇到的情況, 和大家分享. 沒有總結好的地方，大家補充。
篩選之前確定G418濃度：
1，由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。
2，G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質的合成而殺死細胞的。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進行轉染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉轉染時不加其它抗生素。
3，匯合度對G418篩選結果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%
4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3*106個細胞電轉后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內大約50%匯合度。理論上1/4000孔內應有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內有兩三個克隆，按比例1/300孔內應該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。
加藥時間和維持濃度
1，由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經得到表達。一般是轉染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關于維持濃度，有人說細胞會出現對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。
篩選時的培養液
加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題：1， 死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液
2 ，孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養過夜之后收集培養液，通過濾器消毒，和新鮮的培養液按1：1混合備用。再轉染后篩選過程中就可以應用這種培養基。
3，適當增加血清濃度。
篩選時出現的問題及其解決辦法：
1， 問題1。做hela細胞的篩選，現在已經篩選3周，在6孔板中已經長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？
a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；
b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續作用1MIN，這時，消化酶可以繼續作用的，又可避免胰酶擴散；
c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養基，并吸走你的可隆了呀
d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細胞尚未完全松散開，可以再重復的，直到松散開，能夠被吸走為止。
我的建議：1、在100mm dish中挑克隆，細胞分的稀一點。2、把細胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆
2，問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。一般能挑到穩定表達的概率我認為大概有70－80％，但是想挑到表達量高且能穩定表達的，不大容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點太少的緣故。
3，問題3。細胞形態的改變：穩定轉染后陽性克隆均出現不同程度的細胞形態的改變。
想請教各位有經驗的高手，你們做穩定轉染時有此發現嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細胞。不過，我轉的是一種抑癌基因。
4，問題4。單克隆化的時機和個數：加藥篩選時, 一般等到確認的轉染細胞長到70%以上時,再做有限稀釋法, 以克隆出陽性細胞, 同時要保持適當的藥物濃度,以防突變和污染。若細胞長好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個克隆就有需要的克隆，但保險起見，篩10個吧。
5，從單克隆化時開始，就要加大營養，清和生長因子。
單克隆化的操作方法；
1.方法1。單克隆細胞的培養就是這樣的,我現在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應保證每個孔中的細胞是一個,因此,我一般在200毫升的培養液中加入小于96個的細胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結果你所說的現象我也遇到過,我也百思不得其解,只好做多一點的96孔板來補充。培養SPC-A1（人肺癌細胞），轉染了EGFP，然后進行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。
2.方法2。實驗步驟大致為：預先對96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細胞培養液，0.1ml/孔，并放于細胞培養箱中溫育，然后胰酶消化穩定表達GFP的細胞，細胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細胞懸浮液，上述細胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml/孔，從中吸取0.1ml細胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會有某個孔中只有1~2個細胞。
3.方法3。我的改進之處：我在顯微鏡下觀察，標記孔中小于10個細胞的孔，然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單克隆。但需注意的是：時間不能超過30min，否則細胞極容易死亡。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細胞，然后用牙簽練習，我練了5～6次后非常熟練了
培養液：最好是含15％的胎牛血清，加大營養，有利于細胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細胞液進行過濾，過濾后的培養含有很多生長因子，可以作為單克隆的培養液。
4.方法4。我曾經幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺內紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個，然后在96孔板內先加好培養基，再將6孔板內的培養基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細胞狀態，在有些變圓時，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準備好的加了培養基的96孔板內，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細胞松散擴散開了時，已經吸了將近十個克隆了，動作快一些時能吸十幾個克隆，我做過幾次了效果很好，沒有出現污染。（在要進行操作時，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。
