實驗材料 AppliedSpectralImaging ( MigdalHaemekIsrael) 試劑盒組織樣本
試劑、試劑盒 組織培養基秋水仙胺檸檬酸鹽KCl甲醇冰乙醇去離子甲酰胺20 X SCCHClPBS MgCl2分裝標記探針二甲苯
儀器、耗材 解剖刀和刀片 無菌培養皿組織培養瓶培養箱水浴鍋離心管移液槍染色缸熒光顯微鏡
實驗步驟
一、探針
已經標記好的商品探針以混合形式溶解在雜交液中。
二、從組織中制備染色體
1.在組織培養用的超凈工作臺中進行無菌操作，在無菌培養皿中，用刀片將組織切碎成細小的塊。
2.將細碎的組織塊轉入有足夠培養基的、具有通氣孔的組織培養瓶中；培養基要蓋過平面放置的培養瓶底（通常 10~15 mL)。
3.將培養瓶放入 CO2 培養箱中，靜置培養 24 h。
4.光鏡下觀察其生長狀態。
5.當達到要求的生長狀態或培養時間時，向培養瓶中加入秋水仙胺至終濃度 l(ug/mL，在 CO2 培養箱中繼續培養 2~3 h(見注釋 1)。
6.將培養基和懸浮的組織或細胞一起轉移到 15 mL 錐形底離心管（見注釋 2)。對于非貼壁細胞，繼續步驟 10。
7.向培養瓶中加入 IOmL 檸檬酸鹽溶液，漂洗貼壁的細胞，棄去檸檬酸鹽溶液。
8.向培養瓶中加入 10mL 1 X 胰酶。觀察貼壁細胞自培養瓶壁上脫離，輕輕吹打，將細胞自瓶壁上吹打下來，轉移到 15 mL 錐形離心管中。
9.向含有貼壁細胞的 15 mL 錐形離心管內加入 5 mL 新鮮配置的培基（見注釋 3)。
10.1500 g 離心 10min 收集細胞。
11.倒掉或吸出上清，只留下 0.5~1mL 溶液。用手指輕輕敲打管底，打散細胞團。
12.加人預熱的 0.075mol/L KCl 溶液，開始的 1mL 逐滴加入，滴加中間混勻（見注釋 4); 然后將剩下的 14mL 加入并輕輕顛倒混勻，37°C 放置 10min。
13.加入 5 滴比例為 3:1 的甲醇：冰乙酸，混勻（見注釋 5)。
14.1500g 離心 10min。
15.倒掉或吸出上清，打散細胞團（見注釋 6)。加入新鮮配置的甲醇：冰乙酸（3:1) 固定液 15 mL，用上述的方法開始的 ImL 逐滴加入，滴加中間混勻；然后加入剩余的 14 mL 固定液，并輕輕顛倒混勻。
16.1500 g，離心.10min。
17.重復步驟 15 的固定。然而，最初的 1mL 不需要逐滴加人。離心，重復固定 3 次。
18.細胞懸液可以以固定液中細胞團的狀態 -20°C 保存。
19.為了進行染色體標本制備，倒掉固定液，重懸細胞團塊，加入適量的新鮮固定液使懸液輕度渾濁。
20.用 200ul 的槍，吸取 100ul 懸液，滴到干凈的載玻片上（見注釋 7)，室溫下晾干并儲存片子。滴好的片子至少自然老化 2d 或 37°C 過夜老化。
三、染色體標本預處理和變性
1.染色體標本至少自然老化 2d 或用前 37°C 過夜。
2.染色體標本在系列乙醇（70%、80% 和 95%) 中分別脫水 5 min，晾干。
3.加入 15~20uL 的 10% 胃蛋白酶儲存液（見注釋 8) 到 50 mL 預熱的 O.Olmol/L HCl 中，將染色體標本在 37°C 染色缸中溫育 5 min(見注釋 9)。同時，準備一缸 70% 甲酰胺/2 X SSC 溶液并放入 75°C 水浴中預熱。
4.取出標本，在室溫下的 1 X PBS 中漂洗 5 min。
5.在 1 X PBS/MgCl2 室溫溫育 5 min。
6.向 50 mL l X PBS/MgCl2 中加入 1.5 mL37% 甲醛，在室溫下的該溶液中溫育標本 10min(見注釋 11)。
7.在室溫中的 1 X PBS 中漂洗 5 min。
8.按步驟 2 中所述方法再次進行系列乙醇脫水。
9.晾干片子后，檢查甲酰胺溶液的溫度是否達到 75°C(見注釋 11); 將染色體標本在 75°C 甲酰胺溶液中變性 2 min。
10.迅速將標本轉移到冰冷的 70% 乙醇中并用系列乙醇脫水（見注釋 12) 后晾干。
四、探針變性
1.對于每張標本，22 mm X 22 mm 蓋玻片的范圍內需要用 10uL 探針；如果該區域大于此范圍，增加探針的使用量。取適量的探針到一個 Eppendorf 管中。
2.在水浴鍋或 PCR 儀上 75°C 熱變性探針 10min。
3.將探針于 37°C 水浴中預復性 lh。
五、雜交
1.從 37°C 中取出預復性的探針，小心的加到變性的中期染色體標本上。因為探針既有直接標記又有間接標記，應迅速操作并避免長時間暴露在光線條件下。
2.小心的蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡。如果出現氣泡，輕按蓋玻片，將氣泡擠出。
3.用橡皮泥封好蓋玻片邊緣。
4.放入雜交盒（見注釋 13)，并放入塑料袋中（可選擇的），在 37°C 條件下雜交 48 h。
六、雜交后洗脫和檢測
1.在 45°C 水浴中預熱所有的溶液。
2.從雜交盒中取出片子，小心除去橡皮泥。蓋玻片也許隨橡皮泥一塊揭去或仍留在片子上。如果蓋玻片留在片子上，直接將標本放入第一缸洗脫液。
3.在 50% 甲酰胺/2 X SSC 中洗 3 次，每次 5 min。在第一次洗脫時蓋玻片應滑掉。輕輕振蕩染色缸幾秒鐘（見注釋 14)。
4.在 1 X SSC 中洗片 3 次，每次 5 min 并輕輕振蕩。
5.標本浸在 0.01%Tween-20/4 X SSC 中，取出標本，甩掉多余的液體，但保持片子表面濕潤。
6.取 30~40uL SKY 試劑盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 2 中的封閉液加到標本上，蓋上蓋玻片。
7.將標本放回雜交盒，37°C 溫育 30 min。
8.小心移開蓋玻片，取 30~40pLSKY 試劑盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 3 中的檢測溶液加到片子上，并蓋上蓋玻片。
9.將標本放回雜交盒，37°C 溫育約 30 minD
10.小心移開蓋玻片，在 0.01%Tween-20/4XSSC 中洗 3 次，每次 5 min。輕輕振蕩。
11.甩掉多余的液體，取 30~40ul SKY 試劑盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 4 中的檢測溶液加到標本上，蓋上蓋玻片。
12.將標本放回雜交盒，37°C 溫育 30 min。
13.小心移開蓋玻片，在 0.01%Tween-20/4XSSC 中洗片 3 次，每次 5 min。輕輕振蕩。
14.在室溫下的 2XSSC 中漂洗片子。
15.用 15~20 斗瓶 5 中的 DAPI/抗淬滅劑封片，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。
16.可以進行閱片。標本應在一 20°C 保存。
七、圖像抓取
1.盡可能及時的進行圖像抓取和分析。盡管熒光素在一 20°C 并盡可能少的光線條件下能保存幾個月，但隨著時間的延長，信號強度會減弱（見注釋 17~20)。
2.在實驗室安裝系統時進行用該系統抓取圖像和分析的培訓。
八、用 SKY 探針與曾 G 顯帶過的中期染色體標本的雜交：標本預處理
1.在室溫下的二甲苯中洗 2 次，每次 5 min，除去 G 帶標本上殘留的鏡油 (見注釋 15)。
2.將標本浸在甲醇中 10~15 min 褪色，或直到標本完全褪色。
3.標本褪色后，進行系列乙醇再水合：95%、80% 和 70% 乙醇，每次 5 min，瞭干。
4.繼續從本章 3.3 的步驟 5 開始。
5.如果標本曾顯帶過，在 70% 甲酰胺/2 X SSC 中變性時間需調整以反映標本特性（見注釋 16 和表 1)。保守變性時間為 40s。