免疫組化的操作流程

實驗概要

本文介紹了免疫組織化學實驗操作流程，主要有：脫蠟和水化，抗原修復及免疫組織化學染色等步驟。

實驗原理

免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

主要試劑

1. PBS緩沖液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L。
2. 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB，pH6.0，1000ml)：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
3. 0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H₂O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
5. 酶消化液：

   1) 0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制；

   2) 0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇-H₂O₂溶液：用30%H₂O₂和80%甲醇溶液配制。
7. 封裱劑：
   1) 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0～9.5)等量混合；
   2) 油和TBS(或PBS)配制。
8. TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合于光學顯微鏡標本。

主要設備

1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐

2. 水浴鍋

實驗步驟

1. 脫蠟和水化脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
   1) 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
   2) 無水乙醇中浸泡5分鐘；
   3) 95%乙醇中浸泡5分鐘；
   4) 70%乙醇中浸泡5分鐘；
2. 抗原修復用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
   1) 抗原熱修復
      a. 高壓熱修復在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。
      b. 煮沸熱修復電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。
      c. 微波熱修復在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。是以高溫，高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。甲醛和蛋白水解交聯過程中氨基酸側鏈上的某些基團(抗原決定簇)如咪唑、吲哚等基團受到影響，通過120℃高溫或強堿處理后，可使交聯打開。

   2) 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3. 免疫組織化學染色
SP法：
   1) 脫蠟、水化；
   2) PBS洗2～3次各5分鐘；
   3) 3%H₂O₂(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
   4) PBS洗2～3次各5分鐘；
   5) 抗原修復；
   6) PBS洗2～3次各5分鐘；
   7) 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
   8) 滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
   9) 4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。
   10) PBS洗3次各5分鐘；
   11) 滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
   12) II抗中可加入0.05%的tween-20。
   13) PBS洗3次各5分鐘；
   14) DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
   15) PBS或自來水沖洗10分鐘；
   16) 蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；
   17) 自來水沖洗10～15分鐘；
   18) 脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法：
   1) 脫蠟、水化。
   2) PBS洗兩次各5分鐘。
   3) 用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
   4) 抗原修復。
   5) PBS洗5分鐘。
   6) 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
   7) 滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時(4℃過夜后在37℃復溫45分鐘)。
   8) PBS洗三次每次2分鐘。
   9) 滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
   10) PBC洗3次每次2分鐘。
   11) 滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
   12) PBS洗4次每次5分鐘。
   13) DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
   14) 蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。
   15) 脫水、透明、封片、鏡檢。