內含肽剪接是一個快速、高效的反應過程，前體蛋白在細胞中幾乎分離不到。反應亦不需要任何輔助因子、酶和ATP能量，其催化結果是將內含肽兩側的外顯肽通過肽鍵連接成成熟的天然肽。基于剪接位點氨基酸殘基的化學性質以及帶分支的剪接中間產物分子的發現，人們提出了多種假說來描述這一反應過程。目前被普遍接受的剪接機制可以拆解為以下四步
（1)N—x酰基轉移(X=0，s) 內含肽起始氨基酸Ser/Cys的側鏈基團一OH/一SH向前一位氨基酸殘基的羰基發動親核攻擊，產生N一0或N—s的酰基重排，打破原來的肽鍵而代之以(硫)酯鍵，將N一外顯肽轉移到內含肽第一個殘基的側鏈上。在中性pH條件下，酰胺一硫酯平衡通常是有利于酰胺鍵形成的。但是，含有內含肽的前體蛋白的晶體結構顯示，位于上游剪接點的肽鍵在構象能級上處于不利的地位。用其他氨基酸殘基替代內含肽N端的SedCys會完全阻斷該剪接位點肽鍵的斷裂。
(2)轉酯：內含肽N端的(硫)酯鍵在C端外顯肽首位氨基酸Cys/SedThr側鏈一OH/一SH基團的親核替代作用下發生斷裂，將N．端外顯肽序列從內含肽的N端轉至C端外顯肽起始氨基酸側鏈上，形成分支中間體。該反應在堿性條件下(pH9—10)可發生逆轉，由分支中間體變回線性前體 。
(3)Asn/Gln環化 Asn的側鏈基團一N 對其自身的羰基發動親核攻擊，使Asn形成氨基琥珀酸五元環結構，同時內含肽與C端外顯肽之間的肽鍵斷裂。在此步反應中，內含肽被釋放出來。與前幾步反應不同的是，Asn/Gln的環化基本上是不可逆的。若用其他氨基酸取代Asn/Gln，則會完全阻斷內含肽C端肽鍵的裂解反應，但并不影響上步反應中(硫)酯鍵中間產物的形成。內含肽C端倒數第二位的His可以輔助與之相鄰的Asn的環化，其突變也會影響C端肽鍵的裂解反應。值得注意的是，前兩步反應似乎并不是第三步C端肽鍵的裂解反應必要前提。因此可采用將靶蛋白直接與內含肽C端融合的方法進行蛋白質的純化和重組 。
（4)外顯肽的連接 連接的兩個外顯肽的(硫)酯鍵自發進行的轉酰基反應，以更穩定的酰胺肽鍵取代(硫)酯鍵，將N端C端外顯肽用天然肽鍵連接起來。