【分享】質譜分析蛋白的原理與方法

　　 質譜技術具有較好的靈敏度、準確度，能準確測定蛋白質。目前質譜主要測定蛋自質一級結構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置，在對蛋白質結構分析的研究中占據了重要的地位。[1,2]質譜有進樣器、離子源、質量分析器、離子檢測器、控制電腦及數據分析系統等組成。傳統的質譜僅用于小分子揮發物質的分析，但隨著新的離子化技術的出現，如基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質譜（ESI-MS）等，各種質譜技術的出現為蛋白質分析提供了一種新的且準確快速的途徑。目前，酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機算法的聯合應用已成為鑒定蛋白質的發展趨勢。

　　質譜法分析蛋白的基本原理是通過電離源將蛋白質分子轉化為離子，然后利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值（M/Z）的蛋白質離子分離開來，經過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白。通常結合相應的處理及其他技術，能夠比較準確、快速地鑒定蛋白質。

　　質譜分析蛋白的方法：

　　用于質譜分析蛋白質的方法主要有三種：肽質量指紋圖譜法（PMF）、串聯質譜法（CID）和梯形肽片段測序法（ladderpeptide sequencing）。

　　肽質量指紋圖譜（PMF）

　　肽質量指紋圖譜（PMF）即用特異性的酶解或化學水解的方法將蛋白質切成小的片段，然后用質譜檢測各產物肽的相對分子質量，將所得的蛋白酶解肽段質量數在相應的數據庫中檢索，尋找相似肽指紋譜，從而繪制“肽圖”。由此可見，分子質量的精確度是PMF的關鍵指標所在，但蛋白質的翻譯后修飾可能使PMF的質量數與理論值不符，故這就需要與序列信息適當結合。

　　串聯質譜法（CID）

　　串聯質譜法（CID）是利用待測分子在電離及飛行過程中產生的亞穩定離子，通過分析相鄰同組類型峰的質量差，識別相應的氨基酸殘基。串聯質譜的肽序列圖需要讀出部分氨基酸序列與前后的離子質量和肽段母質量相結合，這種鑒定方法稱為肽序列標簽（PST）。

　　梯形肽片段測序法（ladder peptide sequencing）

　　梯形肽片段測序法（ladder peptide sequencing），與Edman法有相似之處，是用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，產生包含僅異于1個氨基酸殘基質量的系列肽，名為ladder，經質譜檢測，由相鄰肽峰的質量差而得知相應氨基酸殘基。其中的問題是由于酶解速度不一，易受干擾。

　　蛋白質質譜分析中的問題

　　蛋白質消化

　　蛋白消化蛋白的基團越大，質譜檢測的準確率越低。因此，在質譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質譜檢測的準確率。一般而言，6 -20 個氨基酸的多肽最適合質譜儀的檢測。現今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經胰蛋白酶消化后，會產生相同的多肽。

　　蛋白質修飾問題

　　 在目前條件下，質譜很難100%給出肽段的序列，經常會丟失一些肽段，蛋白質磷酸化修飾也會抑制胰蛋白酶的酶解，并且磷酸化肽的含量較非磷酸化肽段的含量少很多，質譜對磷酸化肽的響應就可能會被抑制。因此，要盡可能把非磷酸化肽段的含量降到最小。減少非磷酸化肽的方法有分餾、IMAC（固相化金屬親和色譜）和抗體結合。

　　通過MALDI-TOF-MS測定肽段的分子量，根據所得肽段分子量比預計的分子量大80Da或其整倍數，判定是否存在磷酸化修飾。

　　精確度問題

　　 在質譜序列測定中，質譜的準確性對測定結果有很大影響，這是由于質譜測序的關鍵在于測定相鄰肽鏈之間的分子量差別以判斷相應的氨基酸殘基。如果測量的絕對質量誤差在0.5以上，則不能夠有效區分質量數差在1以內的氨基酸殘基。