(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養箱內的旋轉平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預雜交1-2小時。
(5) 將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。
(6) 雜交結束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗 一次，同時應避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時。
(10)底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。