分子標記—AFLP原理和操作步驟

DNA樣品

Taq酶 EcoRI  MseIEcoRI  MseI接頭 E+A引物M+C引物 T4DNALigaseE和M引物 瓊脂 過硫酸胺 丙烯酰胺 尿素 硝酸銀 甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸 玻璃硅烷 50bpMark

電泳儀 離心機 Eppendorf管 凝膠成像儀 紫外分光光度計 37℃水浴鍋 PCR儀

一、基因組DNA提取和純化

1. 大量提取DNA（實驗方法視DNA來源而異，此處略）。

2. DNA的純化：

（1）用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進行純化。

（2）首先用TE緩沖液補滿至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次。

（3）離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預冷的無水乙醇，——20℃放置2h以上。

（4）10000xg離心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風干后溶于30μl TE緩沖液中。

（5）紫外分光光度計檢測A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測片段大小。

注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時DNA濃度大約為100ng/ul。

二、限制性酶切及連接

1. 在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5μl 10×酶切緩沖液， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭，雙蒸水補至25μl。

2. 用PCR擴增儀設定37℃過夜反應后，于65℃，20min滅酶活，——20℃保存，作為預擴增模板。

三、預擴增

1. 取3μl酶切連接產物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30μl。

反應參數為：94℃ 90s；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，30循環；72℃ 10min。

2. 反應結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測擴增產物，取3μl產物釋稀50倍，用作選擇性擴增模板。

四、選擇性PCR擴增

1. 取釋稀后的產物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30μl。

反應參數為：94℃ 90s；94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 1min，13循環（每循環降0.7℃）；94℃ 30s， 56℃ 1min，72℃ 1min，25循環；72℃ 5min.

2. 反應結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測先擇性擴增產物。

五、凝膠電泳

1. 擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺膠（厚度0.5mm）和1×TBE電泳緩沖液電泳分離）。拔出梳子，140W恒功率預電泳30分鐘，溫度達到47——49℃。務必使每個孔清洗出尿素。

2. 選擇性擴增產物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍）94℃變性5 min，結束后迅速置于冰上直到點樣。

3. 每個泳道加樣8μl。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，待二甲苯青泳動至玻璃板2/3處，結束電泳。

六、銀染

1. 固定液配制：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。

染色液：1g AgNO₃，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。

顯色液：30g Na₂CO₃，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。

2. 具體操作流程

（1）電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。

（2）固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結束后，固定液保留。

（3）加入去離子水漂洗3次，每次2min。

（4）染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液（4℃），在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤中。

（5）顯色：加入顯色液（4℃），在搖床上輕微震蕩直至條帶數不再增加為止。

（6）終止：加入（2）步驟用后的固定液，來回漂幾分鐘。達到最好效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。

（7）去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用數碼相機拍照。

七、數據分析

用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統計，再用NTSYS軟件計算出遺傳相似性系數，用UPGMA法進行聚類分析構建聚類圖。