第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定
第二章DNA 酶切及凝膠電泳
第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化
第四章RNA 的提取和cDNA 合成
第五章重組質粒的連接、轉化及篩選
第六章基因組DNA 的提取
第七章RFLP 和RAPD 技術
第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
第九章分子雜交技術
第十章測序技術
第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定
第一節概述
把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術,送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質粒是重組DNA 技術中常用的載體。
質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb
不等,為雙鏈、閉環的DNA
分子,并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。F
質粒(又稱F 因子或性質粒)、R 質粒(抗藥性因子)和Col 質粒(產大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。
質粒在細胞內的復制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent
control)和松馳控制型(Relaxedcontrol)。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時,它也不能復制,通常每個細胞內只含有1
個或幾個質粒分子,如F 因子。后者的質粒在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝,一般在20 個以上,如Col E1
質粒。在使用蛋白質合成抑制劑-氯霉素時,細胞內蛋白質合成、染色體DNA
復制和細胞分裂均受到抑制,緊密型質粒復制停止,而松馳型質粒繼續復制,質粒拷貝數可由原來20 多個擴增至1000-3000 個,此時質粒DNA
占總DNA 的含量可由原來的2%增加至40-50%。
利用同一復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在,當兩種質粒同時導入同一細胞時,它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭,在一些細胞中,一種質粒占優勢,而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代后,占少數的質粒將會丟失,因而在細胞后代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統的質粒則可以穩定地共存于同一宿主細胞中。
質粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產生某些抗生素,降解復雜有機物,產生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內切酶與修飾酶等。
質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相比,質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA
序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA
片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質粒載體大小一般在1kb 至10kb 之間，如PBR322、PUC 系列、PGEM
系列和pBluescript（簡稱pBS）等。
從細菌中分離質粒DNA 的方法都包括3
個基本步驟:培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton
X-100 可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS 或Triton X-100 處理后,細菌染色體DNA
會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA
比質粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA
變性,而共價閉合環狀DNA(Covalently closed
circularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA
片段難以復性,而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,而質粒DNA 雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態存在于液相中。
在細菌細胞內,共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA
外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA
兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環狀分子,稱開環DNA(Open circular DNA,
簡稱ocDNA)；如果質粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當提取的質粒DNA 電泳時,同一質粒DNA
其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。
第二節材料、設備及試劑
一、材料
含pBS 的E. coli DH5α或JM 系列菌株，1.5ml 塑料離心管(又稱eppendorf 管),離心管架。
二、設備
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器， 電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。
三、試劑
1、LB
液體培養基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl
10 g，溶于800ml 去離子水中，用NaOH 調pH 至7.5, 加去離子水至總體積1 升,高壓下蒸氣滅菌20 分鐘。
2、LB 固體培養基：液體培養基中每升加12g 瓊脂粉,高壓滅菌。
3、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml 水溶液, -20℃保存備用。
4、溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經使用后便予丟棄。
5、3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解40.81g NaAc?3H2 O,用冰醋酸調pH 至5.2, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。
6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15 分鐘,儲存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH 母液稀釋)，1％ SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
9、RNA
酶A 母液：將RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris?Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl
中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15 分鐘,使混有的DNA 酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf
管分裝成小份保存于-20℃。
10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA
和DNA的交聯,應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/L Tris?Cl
(pH8.0)和0.1mol/L Tris?Cl(pH8.0)緩沖液反復抽提使之飽和并使其pH 值達到7.6以上,因為酸性條件下DNA
會分配于有機相。
11、氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積/體積＝1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。
12、TE 緩沖液：10 mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% TritonX-100。
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
15、電泳所用試劑： （1） TBE 緩沖液(5×)：稱取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。（2）上樣緩沖液(6×)：0.25% 溴酚藍，40% (w/v) 蔗糖水溶液。