第二節RFLP 技術
一、材料
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設備
電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4 塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf 管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE 電泳緩沖液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl 。
四. 操作步驟
1. 基因組DNA 的酶解
(1) 大片斷DNA 的提取詳見基因組DNA 提取實驗,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 沒有降解。
(2) 在50μl 反應體系中,進行酶切反應:
5μg 基因組DNA
5μl 10×酶切緩沖液
20 單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。
(4) 取5μl 反應液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應有大于30kb 的明顯亮帶出現。
[注意] 未酶切的DNA 要防止發生降解, 酶切反應一定要徹底。
2. Southern 轉移
（1） 酶解的DNA 經0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V 過夜)后EB 染色觀察。
（2） 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl 中脫嘌呤, 10 分鐘。
（3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45 分鐘。經蒸餾水漂洗后轉至中和液中和30 分鐘。
（4） 預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC 中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC 鹽溶液吸印,維持18-24 小時。也可用電轉移或真空轉移。
（5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30 秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
（6） 將膜夾于2 層濾紙內, 80℃真空干燥2 小時。
（7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜?
第七章RFLP 和RAPD 技術
第一節概述
DNA
分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment
LengthPolymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP
是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA
水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA
的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA
后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。運用隨機引物擴增尋找多態性DNA
片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA
，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD 技術誕生的時間很短, 但由于其獨特的檢測DNA
多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立于PCR
技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10 聚體)為引物,對所研究基因組DNA 進行PCR
擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA
多態性。RAPD 所用的一系列引物DNA 序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA
序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR
擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA
片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA 片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR
產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR 產物檢測即可檢出基因組DNA
的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD
可以對整個基因組DNA 進行多態性檢測。另外，RAPD 片段克隆后可作為RFLP 的分子標記進行作圖分析。
本實驗將學習RFLP 的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD 技術。探針標記及雜交檢測方法請另詳見分子雜交技術。
第二節RFLP 技術
一、材料
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設備
電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4 塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf 管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE 電泳緩沖液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl 。
四. 操作步驟
1. 基因組DNA 的酶解
(1) 大片斷DNA 的提取詳見基因組DNA 提取實驗,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 沒有降解。
(2) 在50μl 反應體系中,進行酶切反應:
5μg 基因組DNA
5μl 10×酶切緩沖液
20 單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。
(4) 取5μl 反應液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應有大于30kb 的明顯亮帶出現。
[注意] 未酶切的DNA 要防止發生降解, 酶切反應一定要徹底。
2. Southern 轉移
（1） 酶解的DNA 經0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V 過夜)后EB 染色觀察。
（2） 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl 中脫嘌呤, 10 分鐘。
（3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45 分鐘。經蒸餾水漂洗后轉至中和液中和30 分鐘。
（4） 預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC 中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC 鹽溶液吸印,維持18-24 小時。也可用電轉移或真空轉移。
（5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30 秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
（6） 將膜夾于2 層濾紙內, 80℃真空干燥2 小時。
（7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。
[注意] 1、步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。
2、除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進行操作。
3、步驟（4）中,當尼龍膜覆于膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發生, 加蓋濾時也不應有氣泡發生。
4、有時用一種限制性內切酶不能發現RFLP 的差異，這時應該試用另一種酶。
第三節RAPD 技術
一、材料
不同來源的DNA(50ng/ul)。
二、設備
PCR 儀，PCR 管或硅化的0.5ml eppendorf 管，電泳裝置。
三、試劑
1、隨機引物(10mer) (5umol/L)：購買成品。
2、Taq 酶：購買成品。
3、10xPCR 緩沖液：配方見第八章。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP：每種2.5mmol/L。
四、操作步驟：
1. 在25ul 反應體系中,加入
模板DNA 1ul (50ng)
隨機引物1ul (約5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq 酶1 單位（U）
加ddH2O 至25ul
混勻稍離心, 加一滴礦物油。
2. 在加熱至90℃以上的PCR 儀中預變性94℃ 2 分鐘, 然后循環: 94℃ 1 分鐘， 36℃ 1 分鐘，72℃ 1 分鐘，共40 輪循環。
3. 循環結束后, 72℃ 10 分鐘，4℃保存。
4. 取PCR 產物15ul 加3ul 上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊， 分辨率高）。
5. 電泳結束，觀察、拍照。
[注意] 1、電泳時一般RAPD 帶有5-15 條, 大小0.1-2.0kb。
2、特異性的DNA 帶可以克隆作為一個新的分子標記應用。
思考題
1. DNA 酶切反應不徹底會有何結果? DNA 發生降解有何影響？
2. Southern 轉移中脫嘌呤時間為何不能太長？
3. 隨機引物擴增,為什么會產生DNA 雙鏈產物?
第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆