“分子診斷萬花筒”小白篇：CRISPR／Cas技術簡介

今年的諾貝爾化學獎授予兩位女科學家，以表彰她們在CRISPR/Cas技術上的卓越貢獻。隆地熊對于CRISPR/Cas系統能這么早就被諾貝爾獎垂青，深感欣慰。這項技術的出現已經引發了新一代分子診斷的發展。它進一步提升了分子診斷的特異性和靈敏度。回歸后的隆地熊有意對CRISPR/Cas技術進行簡單概述，重新開啟“分子診斷萬花筒”小白篇。

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CRISPR/Cas技術顧名思義就是基于CRISPR/Cas系統的一類生物技術。CRISPR/Cas系統是一種原核生物如古細菌內類人體免疫系統的防御系統，以抵抗外源物質如噬菌體的入侵。首次受到入侵時，外源性遺傳物質會被嵌入形成記憶。當再次受到入侵時，就會及時做出響應進行抵御。

CRISPR是clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats的簡稱，即成簇規律間隔短回文重復序列，在已測序細菌中占約50%，而在古細菌中高達90%。如圖1所示，在序列上CRISPR是由重復區（repeat）和間隔區（spacer）兩部分組成。重復區的序列在同一細菌中高度保守，但不同細菌間有少許差異，片段較短（21-48 bp），含有回文結構。回文結構的特點是單鏈時可形成發卡結構，而雙鏈時能形成十字結構。每個CRISPR/Ca位點中約含2-375個重復區。間隔區則是被細菌嵌入或捕獲的外源性核酸序列，在二次入侵時可充當利箭，直達目標對象。每個CRISPR/Ca位點中約含1-374個間隔區，序列多變，每個間隔區約26-72 bp。

圖1. 典型的CRISPR/Cas位點結構組成

在CRISPR序列上游部分則是啟動CRISPR序列轉錄的前導區（leader），相當于啟動子角色。再往上，就是負責編碼與CRISPR序列共同作用的蛋白質的CRISPR關聯基因，即CRISPR associated genes（cas genes）。其所編碼的蛋白就是Cas酶，即CRISPRassociated proteins（Cas proteins）根據編碼蛋白的序列相識度，已發現的93個cas基因可歸為35個家族，其中11個家族形成cas內核，覆蓋Cas1至Cas9蛋白家族。一個完整的CRISPR/Cas系統至少含有一個能形成cas內核的基因。Makarova等人（Nature Reviews Microbiology,13, 2015:722–736）將目前的CRISPR/Cas系統分為兩大類：Class 1和Class 2。Class 1 CRISPR/Cas系統常常需要多種Cas蛋白合作才能降解外源核酸，而Class 2 CRISPR/Cas系統則只需一種大的Cas酶即可完成降解功能。Class 1 CRISPR/Cas系統內的Cas蛋白有I、III和IV三種；Class 2的Cas蛋白有II、V和VI三種。這六種類型的Cas蛋白又包含19種亞型。比如常見的Cas9蛋白屬于Class 2 II類，Cas12a （又叫Cpf1）屬于Class 2 V類V-A亞型，Cas13a（又叫C2c2）屬于Class 2 VI類VI-A亞型。

目前，研究最為深入且應用最廣的就是CRISPR/Cas9系統。圖2所示為分離自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）Class 2 II-A亞型CRISPR/Cas9系統結構組成。

圖2. 分離自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）Class 2 II-A亞型CRISPR/Cas9位點結構組成

       當外來物種入侵時，CRISPR/Cas9位點啟動轉錄，分別合成出crRNA反式作用體（trans-acting crRNA即tracrRNA）、crRNA前體（precursor crRNA即pre-crRNA）和Cas9蛋白。如圖3所示，Cas9蛋白和tracrRNA首先在pre-crRNA上識別、綁定形成復合體。在RNase III的幫助下，pre-crRNA別切割形成crRNA中間體。而后，Cas9介導二次切割，形成成熟的crRNA。此時，Cas9、mature crRNA和tracrRNA形成功能性復合體，以執行對外源核酸的切割降解。

圖3. S. pyogenes Class 2 II-A亞型CRISPR/Cas9系統中成熟crRNA（mature crRNA）形成過程

至此，大家應該對什么是CRISPR/Cas系統有了初步的認識。事后，隆地熊還會進一步介紹其在基因編輯與分子診斷上的應用。

參考文獻：

1. Jennifer A. Doudna andEmmanuelle Charpentier. Science, 28, 2014. DOI: DOI:10.1126/science.1258096

2. Kira S. Makarova etal. Nat. Rev. Microbiol. 13, 2015: 722-736. DOI: 10.1038/nrmicro3569.

3. Hélène Deveau, JosianeE Garneau and Sylvain Moineau. Annu. Rev. Microbiol. 64, 2010:475-493.DOI: 10.1146/annurev.micro.112408.134123

4. Kira S. Makarova et al. Nat. Rev.Microbiol. 18, 2020: 67-83. DOI: 10.1038/s41579-019-0299-x.