單鏈DNA文庫的SELEX篩選實驗

3' 引物鏈親和素磁珠

電泳儀PCR 儀離心機凝膠成像儀液體閃爍儀長波紫外燈紫外分光光度計核酸定暈儀pH計培養箱振蕩器潔凈工作臺

一、材料與設備

1. 5' '端標記有生物素的 3' 引物。

2. 鏈親和素磁珠（Promega 公司）。

其他設備與試劑與 RNA 文庫方案一致。

二、操作方法

1. 不對稱 PCR 制備 ssDNA

(1) 首先將篩選獲得的 ssDNA 參照 RNA 文庫的實驗方案擴增成雙鏈 DNA，純化回收。

(2) 確定不對稱 PCR 制備 ssDNA 文庫所需的最佳雙鏈 DNA 模板量。取不同量的上述 PCR 產物為模板，不對稱 PCR 擴增 35 個循環。

不對稱 PCR 反應體系如下：10X PCR 反應緩沖液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl )  2 μl，3' 引物（1 pmol/μl )  0.5 μl，dsDNA 模板 不定，Taq DNA 聚合酶（2 U/μl ) 1 μl，加去離子水補齊至 100 μl。

PCR 反應條件：95℃ 預變性 5 min；94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30s，擴增 35 個循環；最后 72°C 終延伸 5 min。

含 7 mol/L 尿素的 12% 變性 PAGE 觀察，單鏈 DNA 條帶應比雙鏈 DNA 的條帶略為偏上，挑選出能產生大量且條帶清晰的單鏈 DNA 的雙鏈 DNA 模板最作為最佳量。

(3) 取最佳雙鏈 DNA 模板量進行大量不對稱 PCR 擴增，含 7mol/L 尿素的 12% 變性 PAGE 切膠純化，然后用核酸定量儀確定 ssDNA 的量用于下一輪篩選。

(4) 在第一輪篩選中，投入的 ssDNA 是直接合成的。

2. 鏈親和素磁珠制備 ssDNA

(1) 用 5' 端標記有生物素的 3' 引物將篩選獲得的 ssDNA 擴增成雙鏈 DNA，純化回收，用 SHMCK 緩沖液溶解至 20 μl。

(2) 鏈親和素磁珠的準備。取 0.5 ml 鏈親和素磁珠用 0.5X SSC 洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min，再用 SHMCK 緩沖液洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min。

(3) 將雙鏈 DNA 與磁珠混合，再加入 40 μl SHMCK 緩沖液，室溫孵育 30 min（在 DNA 混合器上使之充分混合）。

(4) 磁鐵吸附后棄上清，用 SHMCK 緩沖液洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min。

(5) 加入 0.15 mol/L NaOH 400 μl，將雙鏈 DNA 裂解為 ssDNA，于 37℃ 孵育 15 min。

(6) 磁鐵吸附后吸出上清，并加入 20 μl 3mol/L HCl 中和其中的 NaOH，調整其中的緩沖體系為1X SHMCK，0.1% 明膠，12 μg/μL tRNA，總體積為 500 μl，進入下一輪篩選。

防止RNA酶的污染。

一、 防止RNA酶污染的措施 

1.  所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。 

2.  塑料器皿可用0.1％ DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。 

3.  有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3％ H2O2 室溫10min，然后用0.1％ DEPC水沖洗，晾干。 

4.  配制的溶液應盡可能的用0.1％ DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。 

5.  操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。 

6.  設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。 

二、常用的RNA酶抑制劑 

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。 

2. 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。 

3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 

4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。 

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

本實驗來源《RNA 實驗指導手冊》主編：鄭曉飛。