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  • 發布時間:2019-04-08 15:15 原文鏈接: 厭氧微生物的培養實驗——厭氧微生物培養方法

    實驗方法原理焦性沒食子酸與堿性溶液作用后,形成堿性沒食子酸鹽,在此反應過程中能吸收氧氣而造成厭氧環境;牛肉渣內既含有不飽和脂肪酸能吸收氧,又含有谷胱甘肽(glutathione)能形成負氧化還原電位差;厭氧罐是采用某種方法除去其中的氧,例如將鎂與氧化鋅制成產氫氣袋,放入罐中加水反應產生氫,鈀或鉑是催化劑,在常溫下催化氫與氧化合成水,則可除去密封的厭氧罐中的氧。
    實驗材料

    巴氏芽孢梭菌熒光假單胞菌

    試劑、試劑盒

    焦性沒食子酸棉花NaOH石蠟凡士林牛肉蛋白陳葡萄糖NaCl肉膏蛋白胨瓊脂培養基

    儀器、耗材

    厭氧罐催化劑袋氣體發生袋指示劑袋試管玻璃板滴管燒瓶

    實驗步驟

    1.  焦性沒食子酸法


    (1)大管套小管法在大試管中放入少許棉花和焦性沒食子酸,焦性沒食子酸的用量按它在過量堿液中能每克吸收100 ml 空氣中的氧來估計,本實驗用量約0.5 g。接種巴氏芽孢梭菌在小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面上,迅速滴入10%的NaOH于大試管中,使焦性沒食子酸潤濕,并立即放入除掉棉塞已接種菌的小試管斜面(小試管口朝上),塞上橡皮塞或擰上螺旋帽,置30℃培養。


    (2)培養皿法取玻璃板一塊或用培養皿蓋,鋪上一薄層滅菌脫脂棉,將1 g 焦性沒食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養基倒平板,待凝固稍干燥后,在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌,下一半劃線接種熒光假單胞菌,并在皿底用記號筆作好標記。滴加10%NaOH溶液約2 ml 于焦性沒食子酸上,切勿使溶液溢出棉花,立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養皿蓋上,必須將脫脂棉全部罩住,焦性沒食子酸反應物切勿與培養基表面接觸,以溶化的石蠟凡士林液(即vaspar)密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置30℃溫箱培養。


    2.  皰肉培養基法


    (1)取已除去筋膜、脂肪的牛肉500 g,切成小方塊,置1000 ml 蒸餾水中,以小火煮1小時,用紗布過濾,擠干肉汁,將肉汁保留備用。再將肉渣用絞肉機絞碎,或用刀切碎,最好使其成細粒。


    (2)將保留的肉汁加蒸餾水,使總體積為2000 ml,加入20 g蛋白陳,2 g葡萄糖,5 g NaCl和絞碎的肉渣。置燒瓶中搖均勻,加熱使蛋白胨溶化。


    (3)取上層溶液調整pH為8.0,在燒瓶壁上用記號筆標明瓶內液體高度,1.05 kg/cm2,121.3℃滅菌15分鐘后補足蒸發的水量,重新調整pH為8.0,再煮沸10~20分鐘,補足水量,再調整pH為7.4。


    (4)把燒瓶內容物搖勻,將溶液和肉渣分裝于小試管中,肉渣約用,應用無菌手續加入已滅菌的石蠟凡士林,以隔絕氧氣。


    (5)接種前可將上述已做好的庖肉培養基煮沸10分鐘,以除去溶入的氧,如果蓋有一層石蠟凡士林,需將石蠟凡士林先在火焰邊微加熱,使其溶化。在培養基手感不燙時按液體接種法接入巴氏芽孢梭菌,然后將接種的試管垂直,使石蠟凡士林凝固而密封培養基。再置30℃中培養。


    3.  厭氧罐培養法


    (1)用肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平板,凝固干燥后,取兩個平板,每個平板一半邊劃線接種巴氏芽孢梭菌,另一半邊劃線接種熒光假單胞菌,并標記好。取其中的一個已接種的平皿置于厭氧罐的培養皿支架上,而后放入厭氧培養罐內;另一個已接種的平皿置培養室30℃培養。


    (2)剪開催化劑袋,將催化劑倒入厭氧罐蓋下面的多孔催化劑盒內,擰緊催化劑盒的盒蓋。


    (3)剪開氣體發生袋的切碎線處,并迅速將此氣體發生袋置罐內金屬架的夾上,再向袋中加入約10 ml 水。同時,由另一人配合,剪開指示劑袋,將指示條暴露,立即放進罐內。


    (4)迅速蓋好厭氧罐的蓋,將固定梁旋緊,置30℃培養。


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