原位雜交技術和操作步驟詳細介紹

原位雜交技術應用于染色體、細胞和組織切片等樣品中進行核酸特異性檢測，與免疫組化技術的結合應用，能將DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性與樣品的顯微拓撲信息結合起來。1969年Pardue和Gall將放射性標記的探針直接應用于純化核酸的雜交，此后得益于分子克隆技術的發展，及不同探針標記系統和檢測系統的應用，大大增加了原位雜交檢測的應用靈活性和檢測靈敏度。

多種探針標記檢測系統
基于地高辛、生物素和熒光標記分子的標記和檢測系統是常見的原位雜交檢測方法。
熒光標記檢測常為直接探針標記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進行核酸標記。由于標記在核酸上的熒光分子必須經受雜交和洗脫過程中的考驗，以及熒光分子易于衰減，其檢測靈敏度受到一定的影響。但對熒光分子的直接檢測呈現的背景較低。

間接標記的方法中應用了報告分子標記的探針，報告分子通過親和酶促的方法進行顯色。常用的報告分子如地高辛，生物素。結合地高辛抗體或鏈霉親和素上耦聯的酶系統進行間接的底物反應檢測。地高辛標記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時使用的地高辛抗體不會結合于其他的生物分子。這是相較于生物素標記系統的優勢。地高辛抗體上可耦聯堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據不同的應用需求，呈現高信噪比的核酸檢測結果。但需注意，由于引入了免疫檢測反應，在放大檢測靈敏度的同時，應注意樣品內源性酶的滅活，以降低檢測背景。

通過不同標記方法的聯合應用，還可在同一樣本中實現染色體不同區域或細胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過不同的酶促分子反應進行標記。寡核苷酸探針的長度較短，因此避免了探針內部退火的問題，在雜交時的滲透能力也更好，探針與靶標的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時需要控制探針片段長度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長片段的靶核酸序列，增加檢測的靈敏度。
就DNA探針和RNA探針的比較，DNA探針在雜交過程中會出現探針雙鏈之間退火的可能，也更傾向于在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力。而RNA 探針的應用，將提高DNA-RNA雜交子的熱穩定性。
Tips：RNA探針因其單鏈、高分子結合力、可適應高溫雜交的特性，其檢測特異性和靈敏度均優于DNA探針。常用的RNA探針標記方法為構建質粒后進行轉率合成。通過PCR擴增的方法，可以更方便地進行RNA探針的制備；RNA探針合成后，還需驗證其對目標片段檢測的靈敏度和特異性。

原位雜交檢測步驟
原位雜交涉及的步驟：玻片的準備和樣品固定，細胞或組織的預滲透處理，靶DNA變性（DNA原位雜交），探針制備，原位雜交過程，雜交后洗滌，探針（顯色）檢測。

1.      玻片的準備和樣品固定

對于染色體涂片，1：1的乙醇/醚處理的載玻片已能符合要求。對于組織切片的原位雜交，為了在實驗過程中不丟失組織樣品，可使用多聚賴氨酸或鉻礬明膠包被的載玻片。

樣品的固定步驟是為了保持樣品的原有形態學。樣品固定是原位雜交中必不可少的步驟，從化學反應角度來看，固定劑的使用和選擇對后續雜交的影響不會太大，因為核酸雜交的功能分子基團被安全地包裹在DNA雙螺旋結構中，而交聯劑的使用對RNA基本沒有影響。對于染色體涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蠟包埋的組織切片用福爾馬林固定。冷凍切片可通過在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定劑。

2.      樣品預處理

在待測樣品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹纏繞，根據不同的細胞和組織樣品的應用，可選擇合適的預處理方法將靶核酸暴露：

內源性酶滅活：如果探針的檢測是通過酶促法進行的，則樣品內相應的內源性酶必須被滅活。如內源性的POD可通過含1% H2O2的甲醛溶液處理30min。如果檢測酶為AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP檢測的內源性背景一般來說比POD檢測的低得多，因為在雜交過程中，樣品中內源性AP酶的活性基本都喪失了。

RNase處理：在DNA-DNA雜交實驗中，RNase的處理可去除內源性RNA，增加實驗的信噪比。在進行mRNA為靶標的檢測時，RNase處理的樣品也可作為質控對照。通常的處理方式是將DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，樣品在溶液中37℃處理60min。

SSC=150mM NaCl, 15mM 檸檬酸鈉溶液(pH7.4)

HCl處理：對樣本進行20-30min的200mM HCl處理，可將蛋白抽提，并將核酸序列進行一定程度的水解，增加雜交檢測的信噪比。

去垢劑處理：如果對樣品的固定、脫水、包埋等預處理過程不足以將脂膜成分破壞暴露核酸，可對樣品進行額外的蛋白去垢劑處理(如Triton X-100和SDS)。

蛋白酶處理：樣品中待雜交的核酸序列常與蛋白纏繞交聯在一起，樣品的固定步驟更是加劇了蛋白的交聯程度，因此預滲透是核酸雜交前的常規步驟，通常通過蛋白酶K的消化作用來完成。根據不同的文獻來源，蛋白酶K的工作濃度通常設為10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶濃度可根據具體樣品進一步優化)，對樣品進行37°C 7.5 –30 min的處理。染色體涂片或核片的蛋白酶K處理濃度可降至1μg/ml消化7.5   min。也有文獻指出，福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片樣品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）將得到較好的蛋白消化結果。

對于結締組織，肝組織等樣品，還可進行Collagenase和Dispase的組織消化處理，以降低背景。

3.      探針制備

在進行研究前，確定應用的探針類型。不同探針類型的優劣勢請見上文描述。DNA探針的制備包括了前期的DNA片段分離純化（或cDNA的克隆）和酶促探針標記，可選隨機引物標記法和缺口平移法等。RNA探針的制備包括了轉錄載體克隆和轉錄法探針標記。寡核苷酸探針的制備要求先獲得合成的寡核苷酸片段，再進行末端標記或加尾法探針標記。但無論采用何種標記探針及標記方法，對探針標記效果需進行最終的評估，并準確計算探針濃度。

4.      原位雜交過程

雜交前可進行預雜交，以防止較高的背景染色。預雜交條件與雜交條件相同，只是預雜交液中不含探針和硫酸葡聚糖（見下）。

靶DNA的變性（對mRNA的原位雜交無需此步）

樣品DNA的變性在DNA-DNA雜交檢測中是必須的步驟，但同時可能會造成樣品形態學的部分破壞，此步是實驗中需要優化的一個步驟。常用的變性方法為堿變性和熱變性，實驗時可以摸索變性時間、變性溫度等參數以獲得最佳條件。

如使用熱變性方法，可在雜交時將探針的變性和樣品DNA變性同步進行：將樣品和探針溶液加蓋蓋玻片，置于烘箱80℃變性，染色體DNA樣品處理2min，后冷卻至37℃進行雜交。組織樣品DNA的變性時間可增加至80℃10min。

雜交流程

雜交液的成分主要影響了核酸雜交的復性動力學和熱穩定性。雜交液的基礎成分為：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），異源核酸（如鯡精子DNA/tRNA/競爭DNA），磷酸鈉，EDTA，SDS，鹽離子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及雜交探針。不同的應用中進行雜交溫度、pH、鹽離子、甲酰胺、探針濃度等條件的優化。常用的pH范圍為6.5~7.5，較高的pH值有助于提高雜交的嚴謹性。

雜交液中的陽離子濃度通過靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩定性。大于0.4M的Na離子濃度，對Tm值、雙鏈復性速率的影響不大，但隨著Na離子濃度的降低，將顯著影響Tm值和雙鏈復性速率。

有機溶劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+   90~100℃的條件下變性，那么應用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進行長時間變性，這將導致樣品形態學的破壞。50%甲酰胺的應用能將雜交溫度降至30~45℃。

硫酸葡聚糖具有很強的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會使得核酸分子無法獲得周邊親水環境，增加了探針濃度，加快雜交反應速率。

雜交常用條件：50% 去離子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、載體DNA/RNA (1 mg/ml)、探針(20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下雜交5 min - 16 hours

對于短鏈的寡核苷酸探針，具有特殊的雜交動力學和雜交體穩定性，可嘗試從以下雜交條件開始優化：25% 去離子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、載體DNA/RNA (1 mg/ml)、探針(20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下雜交2 - 16 hours

雜交后的洗滌

雜交后進行非特異結合探針的洗脫，同時也可進行單鏈核酸鏈的酶消化。洗脫的嚴謹性可通過調節洗脫液中的甲酰胺濃度、鹽濃度和洗脫溫度。常規洗滌條件為含50%甲酰胺的2×SSC。但在實際的實驗中發現，對于提高雜交檢測的特異性，嚴謹的雜交條件比嚴謹洗滌更為有效。

5.      免疫細胞化學反應(報告分子標記的探針)
如果使用間接檢測的方法，通常需引入免疫細胞化學反應進行酶免反應和底物檢測。免疫檢測前進行樣品的封閉能防止檢測時的高背景。如進行生物素標記的探針雜交和檢測，在含Tween 20 和BSA的PBS中進行封閉。

如進行DIG標記的探針雜交和檢測，在含Blocking Reagent的Tris-HCl緩沖液中進行封閉。如果抗原抗體的結合能不受高鹽條件影響，檢測時加入0.4 M NaCl將有助于防止背景染色。封閉后再進行抗體孵育反應，通常是在保濕容器中進行37°C  30 min孵育(或室溫2h孵育)。抗體結合后在含Tween 20的緩沖液中進行3次5–10 min的洗滌。

酶反應顯色：使用POD和底物DAB/咪唑構成的顯色系統、AP和底物BCIP/NBT構成的顯色系統；酶免反應的檢測靈敏度提高，成色后色原性物質的穩定性和定位功能更好。另外，AP還有一種用于熒光檢測的底物HNPP/Fast Red TR, 用于提高熒光檢測的靈敏度。

6.      顯微鏡檢測
POD和AP的底物顯色反應后使用普通的顯微鏡鏡檢，且顯色可永久保留。該檢測手段能滿足大部分研究的靈敏度需求。對于樣品厚度較高或密度較大的情況，可使用相差顯微鏡進行鏡檢。

如使用熒光標記的探針，則在雜交和洗滌步驟后直接用熒光顯微鏡觀察。熒光探針配合熒光顯微鏡的檢測是進行多重探針檢測的良好手段，檢測時建議使用抗熒光衰減封片劑，以減緩熒光淬滅。DNA復染用的PI或DAPI可直接溶于封片液進行染色(40 ng DAPI/ml; 100 ng PI/ml) 。

該文獻對組織切片和FFPE樣品的原位雜交檢測步驟進行了詳盡的探索和優化，簡化了實驗的操作步驟，并能在復雜樣品的雜交實驗中原位檢測到低拷貝的靶mRNA表達（20~30拷貝/細胞）。