離心機和轉子
Sorvall RT6000 離心機，H1000B MPC 和 H6000A MPC 轉子（離心微量滴定板用）
專用設備
玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)
微量滴定板（24 孔或 96 孔 [可選])
重復用移液管
可選，請參見步驟 1。
附加試劑
此方案的步驟 2 需要第 1 章方案 26 中列出的電穿孔試剤。
此方案的步驟 3 和 4 需要第 1 章方案 1 中列出的小量質粒 DNA 制備用試劑。
此方案中步驟 10 需要第 4 章方案 13 中列出的酵母 DNA 測序試劑。
載體、細菌和酵母菌株
適用于電穿孔的大腸桿菌 DH5a 或大腸桿菌 KC8(pyrF leuB600 trpC hisB463;CLONTECH)
請參見第 l 章，方案 26。
非特異性誘餌質粒
請參見步驟 6 說明。
PMW112，pRFHM-1
pBait(來自第一階段）
在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主極上生長的具適當表型的酵母克隆（第二階段步驟 21 已鑒定）
酵母菌株 EGY48
方法
陽性質粒的分離提供了兩種分離離散文庫質粒的方法。分離少量的菌落時，將細胞在 SDS 中裂解；分離大量的菌落時，細胞用酶解酶（zymolyase) 裂解。
(1) 從陽性菌落中制備細胞裂解物
1) 少量菌落的分離
一般來講，即使陽性菌落的數目數以百計，一些研究人員也寧愿用這種方法去逐步處理最初得到的全套陽性菌落，而在同時處理約 24~36 個或更少的菌落時，這種方法則是最為好用的。在通常的情況下，利用這個方案結束處的替代方案從普通生長的陽性菌落中區別出單一序列，不失為一個較為有效的方法。
a. 從 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板開始（第二階段步驟 21), 挑取在選擇培養基上呈現合適表型的菌落至 5 ml 的色氨酸缺乏的葡萄糖培養基中，30°C 過夜培養。在這種情況下省掉-Ura-His 篩選可以促進非文庫質粒的丟失，使分離希望得到的文庫質粒變得更為容易。
b. 室溫下使用小型離心機以最大轉速離心毎個培養液中的 1 ml 培養物 1 min, 在 200ul 的 STES 裂解液中重新懸浮沉淀，加入 100ul 直徑 0.45 mm 的無菌玻璃珠，劇烈振蕩試管 lmin。
c. 每個試管中加入 200ul 平衡酚，再次劇烈振蕩 1 min。
d. 室溫下使用小型離心機以最大轉速離心乳濁液 2 min, 分別把水相轉移至新的小離心管中。
e. 每個水相中加入 200ul 的平衡酚和 100ul 的氯仿，振蕩 30s。室溫下使用小型離心機以最大轉速離心乳濁液 2 min, 分別把水相轉移至新的小離心管中。
f. 每個水相中加入兩倍體積（400ul) 的乙醇，翻轉混合，-20°C 冷凍試管 20 min,4°C 條件下使用小型離心機以最大轉速離心 15 min 來回收核酸。
g. 棄去上清。用冷的 70% 乙醇洗滌沉淀，真空條件下使沉淀大致干燥后，在 5~10ul TE(pH8.0) 中重新懸浮每份沉淀。進行步驟 2。
2) 大量菌落的分離
下面制備多批 DNA 的實驗方法是由 Steve Kron(芝加哥大學）建立的，在它是對 Manuel Claro(巴黎基因技術分子實驗室）最初建立的實驗方案的一種放大。需要帶有平板固定器（或托盤、支架）的冷凍離心機和可以重復使用的移液管。
a. 在 24 孔微童滴定板的每個孔中加入 2 ml 2xCM(Glu)-Trp 培養基。用牙簽從主板上挑取假定的陽性克隆到微量滴定板的孔中（第 2 階段步驟 21),30°C 搖動微量滴定板培養過夜。
使用 2X 基礎培養基增加了酵母的產通常可以方便地處理 4 個平板，并在一個離心機中同時離心。
b. 使用帶有平板支架的離心機，4°C、1500 g(使用 Sorvall H1000B MPC 轉子 3000r/min) 離心 5 min。用手甩動平板去掉上清液，平板正面向上放置，搖動或輕輕振蕩平板使細胞沉淀重新懸浮于保留的培養液中。每個孔中加入 1 ml 水輕輕播動平板。
加入新的溶液之前，細胞沉淀最容易重新懸浮于殘余的液體中。可以使用重復用移液管添加溶液。
c. 如步驟 b 般離心，甩掉上清液，重新懸浮細胞沉淀于殘留的上清液中，加入 lml 的拯救緩沖液。
d. 如步驟 b 般離心，甩掉上清液，重新懸浮細胞沉淀于平板上少量的殘留上清液中，每個孔中加入 25ul 的裂解液，搖動或振蕩平板，在旋轉搖床上 37°C 培養平板（需加蓋）約 1 h。
裂解液使用前不需要完全溶解。經過 1 h，酵母細胞凝結為白色的沉淀時，即明顯可見裂解現象。酵母菌株對裂合酶的敏感性各不相同。如果裂解現象出現得很快，那么就使用較少的裂合酶。如果裂解處理的時間過長, 過多的部分溶解細胞墊將可能污染最后的材料。可以通過在相差顯微鏡下檢査細胞來判斷裂解情況。活細抱是帶有黑的暈圈的白色，死細胞是均勻的灰色。裂解會把細胞中的顆粒內容物釋放到培養基中。一旦細胞大部分都變成灰色并且許多細胞已經破裂，即可假定為許多質粒已經釋放了出來。
e. 每個孔中加入 25ul 的 10%SDS。搖動平板完全溶解沉淀。室溫下把平板在桌面上放置 lmin。1 min 后，平板上的孔中應為清亮的、稍微黏稠的溶液。
f. 每個孔中加入 l00ul 的 7.5mol/L 乙酸銨。輕輕振蕩平板，然后-70°C 或-20°C 放置 15 min 直到裂解物被冷凍為止。
乙酸鹽的加入導致了細胞碎屑和 SDS 塊狀沉淀的形成。冷凍步驟促進了大揚桿菌轉化抑制物的去除。
g. 從冰箱中取出平板。一旦開始融解，4°C、3000 g(使用 Sorvall H6000A MPC 轉子 3800r/min) 離心 15 min, 轉移得到的 100~150ul 的清亮上清液至新的 24 孔板中。
要點：一般來說，沉淀材料對上清液的某些污染不能避免。然而為了保證純度，最好犧牲部分產物。
h. 每個孔中加入約 0.7 體枳的異丙醇，搖動平板混合溶液，室溫下沉淀核酸 2 min。按照步驟 g 離心，用手甩動平板去掉上清液。
異丙醇加入后馬上出現渾濁的細小沉淀。
i. 每個孔中加入 1 ml70% 冷乙醇，晃動平板。然后 4°C、3000 g(使用 Sorvall H6000A MPC 轉子 3800r/min)5 min, 用手甩動平板去掉上清液，翻轉平板，讓孔印在紙巾上，讓平板在空氣中干燥。
j. 每個孔中加入 100ul 的 TE(pH8.0)。晃動平板，然后放在桌面上放置幾分鐘，直到沉淀完全掖解。把制備品轉移至小離心管或 96 孔板孔中-20°C 保存。進行步驟 2。
取每份所得制備品來通過電穿孔轉化適宜的大腸桿菌。如果沒有得到足夠的菌落，重新沉淀 DNAs, 再溶解于 20ul 而不是 100ul 的 TE 中, 濃縮 DNA 貯存液。
轉化至大腸桿菌中
如果誘餌蛋白被克隆在攜帶氨芐青霉素抗性標志的特異性 lexA 融合質粒（表 18-1) 中，一定比例的大揚桿菌 DH5a 轉化子將不含這個文庫質粒。解決這個問題的一個方法是分析每個 DNA 制備品的多個轉化子。另一個行得通的方法是通過一株具有 trpC 突變的大腸桿菌傳遞質粒，通過酵母 TRP1 基因補足大腸桿菌 trpC 突變的能力來篩選文庫中的質粒。
(2) 通過電穿孔的方法在感受態大腸桿菌 DH5a 或菌 KC8(pyrF leuB600 trpC hisB463) 中引入 1~5ul 的質粒 DNA 制備品，把細菌鋪在含有 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂板上，37°C 孵育過夜。
(3) 如果質粒 DNA 轉入了，則進行步驟 4, 如果質粒 DNA 轉入了 KC8 中，則：
a. 在 LB/氨芐青霉素平板上重新劃線培養，或復制平板將菌落轉移至細菌用基礎培養基（色氨酸缺乏)，37°CC 孵育細菌過夜。
在這些條件下生長的菌落含有 PJG4-5 文庫質粒，此質粒攜帶的 TRP1 基因有效地補足了細菌 trpC9830 突變。
轉化混合物一開始鋪在 LB/氨芐青霉素平板上比直接鋪在細菌用基礎平板上的生存壓力要小，增加了所得的菌落數，
b. 從一個分離的菌落制備小量的 DNA，按步驟 2 所述利用這些 DNA 轉化細菌 DH5a 細胞。
KC8DNA 的小量制備可用于酵母的限制性酶切、PCR 和重新轉化。然而，我們建議在打算測序之前，使用 KC8 的小量制備 DNA 來轉化更加容易接受的大腸桿菌株，如 DH5a。KC8 制備的 DNA 通常不適合用來進行雙脫氧或自動測序，即使在充分的純化之后情況也是一樣。
(4) 從攜帶文庫質粒的 DH5a 細胞制備小量的 DNA。
要點：一般來說，從原始的陽性相互作用子產生的兩個或三個單獨的細菌菌落制備 DNA 是一個很好的主意。相對于細菌來說，酵母能夠耐受重復多次的帶有相同選擇標志的 2u 庾粒。如果一個單個酵母細胞含有兩個或三個不同的文庫質粒，其中只有一個質粒編碼了相互作用蛋白質，相關的 cDNA 克隆在質粒的分離階段就可能丟失。再者，一般來說，這不是主要問題，平均大概 10% 的酵母細胞將含有兩個或更多的文庫質粒。
(5) 通過對含有相同插入片段的陽性克隆制備的重復樣品來進行限制性酶切分析確證和/或確定是否重復分離到了小量的 cDNAs。
攜帶 EcoRⅠ+I 的文庫質粒分解時將釋放 cDNA 的插入片段，而攜帶有 EcoRI+XhoⅠ+HaeⅢ的文庫質粒分解時將“指示”不要絕望。全部陽性菌落中只有少量的生長時，或相互作用子 cDNA 在文庫中的豐度很低時，真正的相互作用子已經作為單一的陽性克隆被得到。
重要：一些研究人員在這個時候會對 DNAs 進行測序。大量的錢可能浪費在了非特異性相互作用子的測序上，我們強烈建議測序之前應該完成下面所述的酵母轉化和特異性檢測。
陽性相互作用的第二次確證：重復表型和特異性檢測
相互作用蛋白特異性的最終檢測是把來自大腸桿菌的文庫質粒重新轉化到含有“處女型” lexAop-LEU2/lexAop-lacZ/pBait 的菌株中其目的是驗證是否依然可以觀察到依賴相互作用的表型和依然對原來的 pBait 存在特異性。這次驗證將消除假陽性，包括在半乳糖培養基生長或活化轉錄的原始轉化酵母 EGY48 中的突變、與 lexA DNA 結合域相互作用的文庫編碼 cDNAs 以及"黏稠的"并與多個 pBait 混合相互作用的文庫編碼蛋白。
(6) 用下面的幾組質粒轉化酵母株 EGY48, 在 CM(Glu)-Ura-His 平板上篩選菌落。
a.pMW112 和 pBait
b.pMW112 和 pRFHM-1
c.pMW112 和一個非特異性誘餌蛋白
如果篩選中最初使用的 pBeil 能夠激活轉錄，即使很輕微，我們強烈地推薦對照誘餌也應該是能微弱地活化轉錄的非特異性對照誘餌。一般來說，微弱地激活轉錄的誘餌很難與假陽性的背景相區分。一些假陽性也通常與微弭活化的 LexA 融合蛋白發生相互作用。
(7）2~3d 后就可以使用由步驟 6 所得的轉化酵母。使用電穿孔的方法把得自大腸桿菌 KC8 和 DH5a 的質粒引入單個的轉化子 a~c 中。把轉化混合物鋪在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30°C 孵育平板直至菌落長出（2~3d)。
重要：陰性對照也可以作為帶有 pJG4-5 文庫載體轉化子 a~c 的電穿孔樣品。
(8) 為每個需要檢測的文庫質粒制作一塊 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板。通常情況下，最接近的文庫質粒轉化子 a~c 在平板上劃線培養有助于簡化非特異性相互作用單元的檢測。
重要：毎一個平板也應該包含轉化了 pJG4-5 陰性對照的 a~c 系列。
(9) 正像第二階段步驟 21 所描述的那樣，檢測β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸營養缺陷型。
(10) 分析這些特異性檢測的結果，并對所得陽性分離物進行測序（請參見第 4 章方案 13)。