在生物學中，同工酶可用于研究物種進化、遺傳變異、雜交育種和個體發育、組織分化等。例如最原始的脊椎動物七鰓鰻(Lamprey)只有一種LDH肽鏈，進化到較高級的魚類才有A、B兩類肽鏈。又如通過對地理分布不同的物種間某一同工酶譜的普查可以推測物種的地理來源。動、植物的遺傳變異可通過子代和親代同工酶譜的比較來鑒別。法醫學中也可用多種同工酶譜的分析來鑒定親子關系。細胞雜交或植物雜交育種后是否出現新品種也可用同工酶譜的比較來確定。在個體發育中，從胚胎到出生，再到成年，隨著組織的分化和發育，各種同工酶譜也有一個分化轉變的過程。某型同工酶在胚胎的大多數組織中出現，成為主要型式，稱為原始型同工酶。但出生后在某些組織中逐漸減少而被另一型同工酶取代，后者在胚胎組織中幾乎不存在或含量極微，只在分化成熟的少數組織中存在，稱為成年型同工酶。在植物的不同發育階段，同樣可見同工酶譜的相應改變。
在醫學方面，同工酶是研究癌瘤發生的重要手段，癌瘤組織的同工酶譜常發生胚胎化現象，即合成過多的胎兒型同工酶。如果這些變化可反映到血清中，則可利用血清同工酶譜的改變來診斷癌瘤。此外。因同工酶譜有臟器特異性，故測定血清同工酶常可較特異地反映某一臟器的病變，如血清的LDH1(B4)或MB型肌酸激酶(CK-MB)增加是診斷心肌梗塞較特異的指標，較測定血清LDH或肌酸激酶(CK)總活力更為可靠。