在線樣品制備的LC／MS／MS測三聚氰胺

Turbo Flow在線樣品前處理和TSQ Quantum LC/MS/MS系統在乳制品中三聚氰胺的分析中具有方便快速和高靈敏度的特點，可以在5~10min內直接分析含量低至10ppb三聚氰胺的奶粉及乳制品樣品，并獲得超過3000的信噪比。

2007年，美國國家食品安全與技術中心借助Thermo Scientific TSQ Quantum UltraTM 三重四極桿液相色譜串聯質譜儀，建立了一種新的液相色譜串聯質譜方法測定食品中的三聚氰胺。今天，Thermo Fisher Scientific將獨有的在線樣品前處理技術Turbo Flow色譜凈化和TSQ Quantum LC/MS/MS分析結合，使分析流程得到大大簡化，并實現了操作自動化。Turbo Flow是一種可以除去復雜樣品中蛋白質等大分子成份的在線樣品凈化方法，因而不需要傳統的蛋白沉淀、液液萃取和SPE等步驟，有效縮短了樣品預處理的時間，提高了分析速度，同時提高了數據的可靠性，檢出限低至10ppb，而且降低了分析成本。在針對建立快速檢測方法以應付全國食品安全的突發性事件時具有實用意義。另外，在方法中還用了QED MS/MS功能進行全譜掃描后再作譜庫檢索，該數據是在同一次進樣中得到的，提供了額外的確證信息。

圖1.  1ppb的三聚氰胺、三聚氰酸和其內標物--13C3標記的三聚氰胺和三聚氰酸的色譜圖（由上至下依次為：三聚氰酸、13C3標記的三聚氰酸、三聚氰胺、13C3標記的三聚氰胺）。

藥品和試劑

除了特別說明的試劑外，所有使用的有機溶劑均為色譜純，并購自Thermo Fisher Scientific（Fair Lawn, NJ, USA）；三聚氰胺和30％（w/w）氨水購自Sigma （St. Louis, MO, USA）；所使用的內標是13C3標記的三聚氰胺，由13C3氯化三聚氰標記，也購自Sigma（St. Louis, MO, USA）；Milli-QTM超純水系統提供了18MΩ的實驗用水，Milli-QTM超純水系統購自Millipore（Billerica, MA, US）。

標準溶液制備：先用50%（v/v）甲醇水分別配制1000μg/ml的三聚氰胺溶液。分別取1ml上述溶液，用1:3的水-乙腈進行稀釋，獲得終濃度為10μg/ml的儲存標準溶液。另外，分別取10μg/ml的儲存標準溶液1ml，用乙腈進行連續稀釋，獲得1~1000ng/ml范圍內的8個標準工作溶液。取50μl內標儲存標準溶液分別加入到1ml上述8個標準工作溶液中，即為校正標準溶液。

圖2.  三聚氰胺的標準曲線（濃度范圍為1~1000ng/ml，左圖給出的是1~1000ng/ml完整范圍內的標準曲線，右圖則是左圖中10~100ng/ml區段的放大）。

樣品制備：取固體樣品0.5g，加入內標準品，用1.5ml（1:1）乙腈/水抽提，離心，取上清液。

分析方法

Turbo Flow色譜條件

儀器：Thermo Cohesive Turbo Flow Systems；

色譜柱：CycloneMCX 0.5x50mm；

流動相：上樣：0.1%甲酸水溶液，洗脫：甲醇/2%氨水（50:50）；

進樣體積：20μl；

液相色譜條件

色譜柱：BioBasicTM AX（Thermo Fisher Scientific, Bellefonte, PA），粒徑5μm、內徑2.1mm、長150mm（或50mm），柱溫：30℃。最初流動相為乙腈-異丙醇-50mM 醋酸銨，其各組份比率為85:10:5，流速為400μl/min。5min以后，流動相立即改變為9:1的水-乙腈，流速轉換為500μl/min，平衡5min。流動相再變回到最初的流動相，流速也換回到400μl/min。在最初的1.5min里，柱子另一端的流出液接入廢液，隨后接在質譜上，即運行保留時間。

圖3.  三聚氰酸的標準曲線（濃度范圍為1~1000ng/ml，左圖給出的是1~1000ng/ml完整范圍內的標準曲線，右圖則是左圖中10~100ng/ml區段的放大）。

質譜條件

質譜：TSQ Quantum Ultra系列質譜儀（Thermo Scientific）；

源極：加熱電噴霧離子源（H-ESI）；

離子化：正離子電噴霧離子源；

鞘氣壓（N2）：65 units；

輔助氣壓（N2）：35 units（250℃）；

離子傳輸管溫度：350℃；

掃描時間：200ms；

Q1/Q3分辨率:0.7FWHM。

SRM離子對

13C3標記的三聚氰胺                  三聚氰胺（內標）

m/z127→68@ 32eV                   m/z130→70@ 32eV

m/z127→85@ 18eV                   m/z130→87@ 18eV

QED-MS/MS條件

碰撞能量：30eV；

反向碰撞能量（RER）：50eV。

結果圖1是三聚氰胺、三聚氰酸、13C3標記的三聚氰胺和三聚氰酸的標準色譜圖。圖2、3分別為三聚氰胺、三聚氰酸濃度范圍為1~1000ppb的標準曲線，該標準曲線在整個濃度范圍內具有較好的線性關系。同時，在圖中也給出了該曲線中1~100ppb區段的放大圖。從圖4可以看出，在奶粉樣品譜圖中有三聚氰胺、三聚氰酸相應的尖峰，其分別為10ppb、50ppb，而且其他雜峰也很少。可見，Turbo Flow在線樣品前處理對除雜質有很好的效果。另外，通過使用QED-MS/MS掃描功能收集到全譜數據，QED-MS/MS是指當一個特殊的SRM反應達到閾值水平時，MS/MS全掃描功能就被激活。全譜掃描數據在譜庫中進行搜尋，從而對目標成份進行確認，并消除假陽性。

圖4.  奶粉中三聚氰酸、三聚氰胺分析檢測色譜圖，其含量分別為50ppb、10ppb。

三聚氰胺含量為10ppb的奶粉樣品QED-MS/MS全掃描譜圖在譜庫中進行搜尋時，譜庫給出最匹配化合物為三聚氰胺（見圖5）。

圖5.  10ppb三聚氰胺譜圖對照譜庫的搜尋結果，三聚氰胺跟其匹配率最高。

圖5的左下四分之一處是樣品的譜圖和譜庫給出的匹配標準譜圖，上面為樣品譜圖，下面為譜庫給出的匹配標準譜圖。從圖上可見兩者有很好的匹配度。

結論

文章介紹了一種專門針對乳制品中三聚氰胺、三聚氰酸進行檢測并定量的方法，經證實，該方法中的在線樣品前處理，免除了傳統使用的蛋白沉淀、液液萃取和SPE等步驟，因此操作簡單、速度快、靈敏度高，檢出限可低至10ppb。該方法可被用于高通量快速定量和確證分析。另外，QED-MS/MS得到的全譜掃描功能，允許在譜庫中進行結果對比查找，從而避免了假陽性。