與II型核酸內切酶有關的幾個概念
粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。
平 末 端 ：Blunt end在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產生的平齊末端結構。則不易于重新環化。
同裂酶：isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。
同尾酶：isocaudamers識別的靶序列不同，但能產生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一組同尾酶。
注 意： 由同尾酶產生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。
（五）限制性核酸內切酶的消化反應
一個限制酶單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37℃）下，1h內中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。
影響酶活性的因素很多，最重要的有：
⑴ DNA的純度
⑵ DNA的甲基化程度
⑶ 酶切反應的溫度（通常為37℃ ）
⑷ DNA的分子結構
⑸ 核酸內切限制酶的緩沖液
在“非最適的”反應條件下,有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會發生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現象叫星號活性。用*表示。
二、 DNA連接酶及其應用
（一）DNA連接酶的發現
環形DNA分子的發現使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。
首個DNA連接酶(ligase)——大腸桿菌DNA連接酶，是1967年發現的，是大腸桿菌基因編碼。
1970年，發現了T4DNA連接酶，由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。
（二） DNA連接酶作用特點
1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3’－OH和5’－P，而且這兩個基團彼此相鄰；
2. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。
E.coli DNA連接酶 －連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），現在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。
T 4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。
（三） DNA連接酶的反應條件
影響連接效率的因素有：
1. 溫度（通常在4-15℃ ）
2. ATP的濃度(10μM／L - 1mM／L )
3. 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，黏性末端僅需0.1U）
4. 反應時間（通常連接過夜）
5. 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）
（四）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案
1．連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。
2．10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1～5∶1），補足ddH2O 至8μl。
3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl，稍加離心，在適當溫度（一般14-16℃）連接8-14hr。
三、DNA聚合酶及其應用
（一）大腸桿菌DNA聚合酶I
是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：
5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
從游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。
大腸桿菌DNA聚合酶I 的三種用途
1.利用缺口轉移法制備高比活度的DNA探針
利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
2.用于DNA連接前的大缺口填充
利用5′--3′的聚合酶活性。
3.用于DNA的序列分析
利用5′--3′的聚合酶活性。