基因組學：將數字信息轉化為生物學功能

優勢 ·      同時檢測克隆和定量熒光標記---使用表現型篩選克隆   ·      從加樣、涂布到挑取完全自動化工作流程   ·      從樣品涂布到挑取、復制和重排記錄并追蹤樣品數據   ·      每天準確挑取超過30000個篩選到的克隆，效率>98%   美國能源部聯合基因組研究所（DoE JGI）的研究人員已經開發出了建立在高通量篩選技術基礎上的合成宏基因組學技術。這種技術可以將最新一代測序獲得的大量數字信息轉化為有形的、可觀察到的生物體。   簡介   新一代測序技術  已經發現了數以百萬計的新型基因，包括所有的已知通路和功能活性。這些新型基因里面包括了大量新型生物酶的基因，在能源和環境技術方面具有潛在用途，包括基礎研究以及應用生物學技術等。最大的一個挑戰就是如何將大量的數字信息（序列，生物信息學，化學信息學）轉化為可以觀察、具有功能活性的生物（酶活性，細胞死亡，蛋白表達等）。   DoE JGI已經開發出了合成宏基因組學技術來克服這一挑戰。基因和通路以一種不依賴模板的方式被合成，快速經濟有效地將數字信息轉化為生物化學分子。   對于商業化生產纖維質生物燃料來說，一個主要的瓶頸就是缺少具有穩定高活性的酶，用于將生物質轉化為葡萄糖。離子液體可以被用于前處理溶解纖維素，增加可發酵糖的含量如葡萄糖。為了尋找合適的工業相關的酶，要使用合成宏基因組學方法。能源部聯合生物能源研究所（JBEI）設計了特殊工業用途的酶，這些酶要具備下面的條件：（i）70度的時候仍具有功能性酶活；（ii）pH4.5條件下仍然穩定；（iii）對離子溶液具有耐受性。這個項目開始的時候，沒有酶能夠在這些條件下具有足夠的活性。   Figure 1. 合成宏基因組學流程：DoE JGI使用的一個宏基因組學研究流程宏基因組學研究的標準流程圖：在克隆和挑取階段使用QPix460系統可以顯著縮短整個流程的時間，增加效率，避免了耗費人力易出錯的人工過程。全自動的工作流程一周可以準確處理上萬個克隆，而且從涂布到挑取，具有完整的數據記錄追蹤，大大節省成本。     第一個研究目標就是已知的可以催化纖維二糖轉化為葡萄糖的GH1s酶家族。基于系統發育的方法使我們能夠從已有的上千序列里面選取200個基因，獲得最大的功能多樣性。200個基因里面，其中180個基因被合成，然后使用QPix460系統克隆到表達載體（Figure 2）。   Figure 2. 宏基因組學系統發育樹分析，選擇有代表性的基因家族

DoE JGI開發的高通量自動化流程包括平行轉化、涂布以及從每個基因變異里面挑取多樣的克隆，用于測序鑒定。QPix460系統使這些成為可能，在一個平臺上面可以提供高通量的接種、涂布以及克隆挑取。一旦序列驗證正確，每個基因的最優克隆被轉化到蛋白表達菌株。   然后分析GH1蛋白生產菌株的蛋白表達可溶性。65%克隆表達的蛋白具有可溶性，然后在上面描述的條件下進一步分析。例如，作為早期質量控制，在不同溫度條件下分析一系列酶的活性，結果顯示，其中一些候選酶具有熱穩定性（Figure 3）。    Figure 3. GH1酶家族活性鑒定，發現具有熱穩定性的酶

為了評估這些候選酶在不同條件下的特性，需要約15000個反應，篩選這些反應就需要一個超高通量的技術。為此目的，使用了一個基于質譜的高通量技術——納米結構啟動質譜（NIMS）。酶-底物反應物被點樣到固相載體上，并通過激光電離。通過檢測底物和產物的比值確定酶的活性（Figure 4），選取活性在前20的酶進行深度研究，其中有5個在上面描述的工業相關條件下具有活性。這表明使用合成宏基因組學可以從公共序列數據庫預測的蛋白開始，快速找到具有特殊活性的酶。    結論    這些工作證明DoE  JGI開發和使用的技術可以成功地將數字信息轉化為生物學相關、具有新功能的酶。來自于GH1酶家族的180種蛋白，經過QPix460系統的高通量、自動化篩選，最后成功找到符合要求的、具有新特性的酶蛋白。這個系統已經成為高效、自動化開發和管理宏基因組庫的不可缺少的組成部分。  此外，使用這個高效的自動化系統，成功篩選到5個具有新特性的酶。這些酶在70°C、pH 4.5、高濃度離子溶液中和底物仍然具有較好活性，能夠滿足工業化的要求。JBEI目前正在研究這些酶的潛在工業化用途，如能否有效工業化放大，將生物質轉化為葡萄糖。    參考資料   1. A nanostructure-initiator mass spectrometry-based enzyme activity assay. Northen TR, Lee JC, Hoang L, Raymond J, Hwang DR, Yannone SM, Wong CH, Siuzdak G. Proc Natl Acad Sci USA.  2008 Mar 11;105(10):3678-83. doi: 10.1073/pnas.0712332105. Epub 2008 Mar 4.  PMID:18319341 [PubMed - indexed for MEDLINE]   目前使用QPix從事相關應用的國內外用戶： 1、US Department of Energy’s Joint Genome Institute (DoE JGI)         QPix460 2、美國可再生產品制造商Amyris    購買了3臺QPix  （開發使用藻類生產生物燃料和將甘蔗轉化為乙醇） 3、武漢生物技術研究院  合成生物學實驗室    QPix460