將外源DNA導入靶細胞后，利用基因重組，將外源DNA與靶細胞內染色體上同源DNA間進行重組，從而將外源DNA定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點。
對于不同的生物體，所使用的基因打靶的方法也不用。對于小鼠來說，大致的流程如下：
從小鼠胚胎上提取干細胞；
同時，構建靶載體，靶載體中含有與靶基因同源的DNA片段；
將靶載體轉染到干細胞中；
將篩選后獲得的含有靶載體的干細胞進行擴增；
將含有靶載體的干細胞注入小鼠胚胎；
胚胎發育為嵌合體小鼠（部分器官為該改造后的干細胞發育而成）后，通過選擇性培育（將嵌合體小鼠與正常小鼠交配，在下一代中進行篩選），獲得基因敲除小鼠（全部器官為該改造后的干細胞發育而成）。
修改后的方法還可用于其他哺乳動物，如牛、羊、豬等。
基因打靶技術還被用于一些植物，特別是小立碗蘚的研究。
