多藥抗藥基因的表達實驗

實驗方法原理 大多MDR細胞膜上出現MDR-1基因及其基因產物P-糖蛋白過度表達。

實驗材料 RNA

試劑、試劑盒 PBS氯仿異丙醇萘酸異硫氰酸肽十二烷基肌酸鈉構櫞酸鈉乙酸鈉二疏基乙醇乙醇Taq酶

儀器、耗材 離心機紫外分光光度計瓊脂糖凝膠電泳PCR儀

實驗步驟

一、細胞總RNA提取

1.  收集約5×107個細胞，冷PBS洗滌。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。

3.  加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。

6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A260/A280應為1.8~2.0）后備用。

二、反轉錄及PCR擴增

1.   引物

2.  取細胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉錄酶反應體系中，42℃保溫30 min 進行反轉錄，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 終止反轉錄。

4.  接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，對cDNA上的目的片段進行PCR

5.  94℃預變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴增35個循環。

6.  最終在60℃保溫7 min，以保證產物充分延伸。

7.  取10 ul 擴增產物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。