大腸桿菌的電擊轉化實驗可以用于：更為簡便快捷地進行轉化。
| 實驗方法原理 | 轉化（transformation）是某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型的細胞的DNA而使它的基因型和表型發生相應變化的現象。該現象首先發現于細菌。也是細菌間遺傳物質轉移的多種形式中最早發現的一種，它不同于通過噬菌體感染傳遞遺傳物質的轉導以及通過細菌細胞的接觸而轉移DNA的細菌接合。 |
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| 實驗材料 | 質粒 DNA |
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| 試劑、試劑盒 | 甘油純水SOC 培養液 |
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| 儀器、耗材 | CYTLBSOB 瓊脂板電擊儀電擊杯冰浴盒液氮 |
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| 實驗步驟 | 一、材料準備
1. 緩沖液和溶液
甘油（10% V/V）（分子生物級），冰上預冷。
純水（Milli-Q 級或與之相當的級別，用預先處理的 Nalgene 濾膜（0.45 μm 孔徑）過濾除菌，放置冰上。
2. 核酸和寡核苷酸
質粒 DNA ( 重組質粒）
3. 培養基
(1) CYT，冰上放置。
10% ( V/V ) 甘油，0.125% ( m/V) 酵母粉，0.25% ( m/V）蛋白胨，本配方來自 Tung 和 Chow (1995)。
(2) LB，預加溫至 37℃
(3) SOB 瓊脂板，含 20 mmol/L MgSO4 和適當的抗生素。
標準的 SOB 瓊脂板含 10 mmol/L MgSO4。
(4) SOC 培養液
每個轉化反應約需 1 ml。
(5) 專用設備
電擊儀和電極間距為 0.1~0.2 cm 的電擊杯。
冰浴盒
液氮
二、方法
1. 細胞的制備
(1) 從新鮮的瓊脂板上挑取一個大腸桿菌單菌落，接種于含 50 ml LB 培養液的錐形瓶 中，于 37℃ 搖動（250 r/min 的搖床）培養，過夜。
(2) 接種兩份 25 ml 的過夜培養物分別到盛有 500 ml 預熱 LB 培養基的 2 L 錐形瓶中，于 37℃ 搖動（300 r/min ) 培養，每隔 20 min 測量一次 OD600 值。
(3) 當 OD600 值達到 0.4 時，迅速將培養物置于冰浴中 15~30 min，不時緩慢搖勻以保證內容物充分冷卻。將離心管置于冰上預冷，為下一步做準備。
(4) 將細菌轉移至冰冷的離心管中，4℃ 用 SorvalI GSA 轉頭（或與之相當的轉頭）以 1000 g ( 2500 r/min ) 離心 15 min，以回收細胞。倒去培養液，用 500 ml 冰冷的純水重懸沉淀。
(5) 4℃ 用 Sorvall GSA 轉頭（或與之相當的轉頭）以 1000 g（2500 r/min）離心 20 min，以回收細胞。倒去培養液，用 250 ml 冰冷的 10% 甘油重懸沉淀。
(6) 4℃ 用 Sorvall GSA 轉頭（或與之相當的轉頭）以 1000 g（2500 r/min）離心 20 min，以回收細胞。倒去培養液，用 10 ml 冰冷的 10% 甘油重懸沉淀。
(7) 4℃ 用 Sorvall GSA 轉頭（或與之相當的轉頭）以 1000 g（2500 r/min）離心 20 min，以回收細胞。小心倒掉上清液，再用連在真空器上的巴斯德吸管吸去管壁上的殘留液體。加 1 ml 冰冷的 GYT 培養液重懸沉淀。
(8) 100 倍稀釋上述懸液后測量 OD600 值。用冰冷的 GYT 培養液將其稀釋至濃度為 2X1010~3X1010 個細胞/ml ( 1.0OD600= ~2.5X1010 個細胞/ml)。
(9) 將 40 μl 上述懸液轉移到冰冷的電轉化儀的電擊杯中（約 0.2 cm 間隙），檢査電擊時是否有短路現象。如果有，那么剩下的細胞懸液用冰冷的 GYT 培養液洗一次，使細菌懸液的電導足夠低（<5 mEq )。
(10) 如果要立即用剛制備的電激感受態細胞，請接步驟 (12)。如果要凍存在 -70℃，將懸液按 40 μl/份分裝到冷卻的無菌 0.5 ml 微量離心管中，封緊管口，沒入液氮中快速冰凍感受態細胞。存于 -70℃ 備用。
(11) 需要用凍存的電轉化感受態細胞時，從 -70℃ 冰箱中取出適當的份數，室溫下待融解后將管轉移至冰上。
2. 電擊轉化
(12) 吸取 40 μl 新鮮制備（或凍融）的感受態細胞入 0.5 ml 冰冷的微量無菌離心管中。與電轉化儀樣品池一起放在冰上冷卻。
(13) 以 1~2 μl 的體積向每一微型離心管中加入 10 pg~25 ng 的待轉化 DNA，置于冰上 30~60 s。包括所有的陽性與陰性對照。
用電擊轉化的 DNA 最好在的濃度范圍溶解在水或 TE ( pH 8.0) 中。如果用 DNA 連接產物直接進行電擊轉化，兩種選擇都是可行的。既可以用 H2O 將連接產物稀釋 10~20 倍，也可用離心層析柱純化 DNA 或采用酚：氯仿萃取和乙醇沉淀的途徑提取 DNA。沉淀的 DNA 要用 70% 乙醇洗滌，而后用 TE ( pH 8.0) 或 H2O 溶解，濃度應在 1~10 μg/ml。
對于構建文庫，高的轉化效率是必需的，而共轉化則是要避免的。DNA 的總濃度應低于 10 ng/ml ( Dower et al. 1988)，用超螺旋質粒轉化 E.coli，常規轉化 10~50 pg 的 DNA 量就足夠了。如果是用亞克隆的質粒進行轉化，應將連接產物稀釋至濃度為 25 ng 的 DNA。
(14) 調節電擊儀，使電脈沖為 25 μF，電壓 2.5 kV，電阻 200 Ω。
(15) 將細菌與 DNA 混合物加至冷的電擊杯內，輕擊液體以確保細菌與 DNA 懸液位于電擊杯底部。擦干電擊槽外的冷凝水和霧氣。將電擊杯放進電擊儀。
(16) 按上述設定的參數，啟動對細胞的電脈沖。儀器應顯示出 4~5 ms 具有 12.5 kV/cm 的電場強度。
電擊杯內的離子可增加溶液的電導，并在含有細胞和 DNA 的溶液中產生電流和弧光或放電。發射電脈沖時，由于電擊槽內爆音的存在使孤光通常顯得很明顯。電擊槽內電荷不均勻的轉移可極大地降低轉化效率。溶液的電導大于 5 mEq (10 mmol/L 的鹽或 20 mmol/L Mg2+ 的溶液）就會產生弧光，高溫也會促使弧光產生。如果弧光只有在 DNA 存在時才產生，就應在步驟13制備 DNA 的過程中去除離子。
(17) 脈沖結束后，盡可能快地取出樣品池，室溫下加入 1 ml SOC 培養液。
有些研究者認為，室溫下加入培養液可造成熱激，從而提高轉化效率。
(18) 將細胞轉至 17X100 mm 或 17X150 mm 聚乙烯試管，于 37℃ 在輕柔振蕩下培養 1 h。
(19) 取不同體積（每 90 mm 板最多可達 200 μl) 的電擊轉化細胞，鋪于含有 20 mmol/L MgSO4 和適當抗菌素的 SOB 瓊脂板。
用超螺旋質粒轉化，可以預計轉化子會很多，因此用無菌接種環接種少許菌液在含有適當抗菌素的瓊脂板（或板的局部）劃線。然而，如果預計到轉化子的數量很少，最好接種 5 塊板，毎塊板的菌液接種量為 200 μl。由于電擊過程中產生的大量死細胞對稀少轉化子的生長有抑制作用，所以我們不推薦采用濃縮的菌液只接種一塊板的方法。
(20) 室溫下待培養板中的液體被完全吸收。
(21) 倒置培養板于 37℃ 培養，轉化克隆應在 12~16 h 內出現。
收起 |
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| 注意事項 | 同一種細菌也可以由于基因型的改變而改變轉化效率。細菌的限制性核酸內切酶能夠分解外來的DNA，所以如果用限制酶失活的突變型菌株作為轉化受體時可以提高轉化效率。通過篩選也可以得到轉化效率顯著下降的突變型，包括吸附能力、吸收能力和整合能力下降的突變型。某些轉化效率降低的突變型對于紫外線格外敏感，這一性質也是許多喪失了DNA損傷修復能力和喪失重組功能的突變型的特性，可見轉化過程中的DNA的整合和DNA損傷修復以及基因重組都涉及某些相同的酶。 |
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| 其他 | 基因型完全相同的細菌可以由于生理狀態的改變而改變轉化效率。能夠吸收外源DNA的生理狀態稱為感受態。許多細菌的感受態都在對數生長期的后期迅速出現，經過一段時間以后便消失。感受態的細菌和非感受態的細菌相比，轉化效率可以高出萬倍。
本實驗來源《分子克隆實驗指南第三版》黃培堂等譯。 |
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