第 3 階段：克隆的擴增與 PCR 產物的評估
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
DEPC 處理過的 H20
TAE 緩沖液，1×（40 mmol/L Tris-乙酸鹽，1 mmol/L EDTA，pH 約 8.5)
DNA 點樣緩沖液（200 g/LFicoll400，0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0,10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚藍，2.5 g/L 二甲苯腈)
dATP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dGTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dTTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dCTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
2. 酶和酶緩沖液
AmpliTaq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer)
GeneAmp PCR 緩沖液，10X(Applied Biosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
載體或基因特異性引物（1mmol/L)
100bp DNA ladder(New England Biolabs)
4. 凝膠
球脂糖凝膠（20 g/L,TAE 緩沖液)
5. 專用設備
薄壁 PCR 板和 Cycleseal PCR 板封板器（Robbins Scientific)
可容納 4 個 50 孔梳子的電泳裝置
熱循環儀
6. 附加器材
瓊脂糖凝膠電泳所需的設備和試劑，包括溴化乙錠
1. 為每個要擴增的 96 孔板配制含有以下成分的主體 PCR 混合液。
PCR 緩沖液，10X(含有 15 mmol/LMgCl2)1000ul
dATP(100mmol/L)20ul
dGTP(100mmol/L)20ul
dCTP(100mmol/L)20ul
dTTP(100mmol/L)20ul
引物 1(lmmol/L)5ul
引物 2(lmmol/L)5ul
AmpliTaq 聚合酶（5U/ul)100ul
DEPC 處理過的 H20 8800ul
2. 標記好 96 孔 PCR 板，在每個孔中分裝 100ulPCR 混合液。
輕扣 PCR 板，確保沒有氣泡殘留在孔的底部。
3. 在每個孔中加入 1ul 純化過的質粒模板，并蓋好蓋子。
4. 進行下面的循環反應。
在進行質量對照的凝膠分析時，將板子保存在 41°C。
5. 通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測 PCR 產物。
凝膠成像只能對產物進行粗略的定量，但可以提供很好的產物組成的特征。
6. 從每個孔中取 2ul, 與 2ul 點樣緩沖液混合。
7. 以 100bp DNA ladder 作為標準，在 2% 瓊脂糖凝膠上分析樣品。
每個泳道應該顯示一條單一的主帶，各泳道之間產物的亮度應該相同。
第 4 階段：PCR 產物的純化與定置
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
乙醇/乙酸鹽混合液 (95% 乙醇，5%3mol/L 乙酸鈉，PH6.0)
乙醇，70%
SSC 緩沖液，20X(3mol/LNaCl，0.1mol/L 檸檬酸鈉·2 H20，用 1mol/LHCl，調 pH 至 7.0)
TAE 緩沖液，1X(40 mmol/LTris-乙酸鹽，1mmol/LEDTA，pH 約 8.5)
DNA 點樣緩沖液（20%Ficoll400,0.1mol/LNa2EDTA,pH8.0，10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚藍，2.5 g/L 二甲苯腈)
2. 離心機和轉頭
具有水平（吊桶式）轉頭的離心機，深 6.2 cm, 可以離心微量滴定板和過濾板（例如，SorvallSuperT21，Sorvall)
3. 核酸和寡核苷酸
100bpDNAladder(New England Biolabs)
雙鏈 DNA 標準樣，變化范圍是 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml
參考雙鏈 DNA(0.5ug/ml)(Invitrogen)
4. 凝膠
瓊脂糖凝膠（20 g/L,TAE 緩沖液）
5. 專用設備
V 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)
Immunowash 微量滴定板清洗儀（BioRad)
紙巾
可熱封的儲存袋和熱封器
65°C 培養箱
可容納 4 個 50 孔梳子的電泳裝置
電泳電源
用于熒光檢測的 96 孔板（Dynex)
熒光計（例如，Perkin-Elmer Analytical Instruments)
6. 附加器材
FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes)
二、方法
1. 在 V 形底 96 孔板的每個孔中，加入 200ul 乙醇/乙酸鹽混合液。
2. 將每個孔中的 100ulPCR 產物，轉到 V 形底的板子中，并用 75ul 移液管吹吸 4 次混勻。
3. 將板子放在-80°C 冰箱 1h, 或者在-20°C 保存過夜。
4. 將板子解凍以降低其脆性，并溶解孔中可能形成的冰。
5. 將板子放入帶有微量滴定板轉頭的離心機中，以 2600 g、4°C 離心 40 min。
6. 用 Immunowash 微量滴定板清洗儀吸去每個孔中的上清液。
建議在每個孔的底部留約 10~20ul, 以避免將沉淀攪起。
7. 用 Immunowash 微量滴定板清洗儀在每個孔中加入 200ul70% 乙醇。
8. 以 2600 g 4°C 離心 40 min。
9. 用 Immunowash 微量滴定板清洗儀將每個孔中的上清液吸去。
10. 用紙巾將板覆蓋，在一個封閉抽屜中干燥過夜。
1.PCR 產物的重懸浮
11. 在每個孔中，加入 40ul3XSSC。用薄片密封器或合適的封條將板子封好，注意要將每個孔都封嚴。
重新懸浮 PCR 產物的緩沖液，是由制作微陣列的點樣儀和芯片決定的。
12. 將板子放在熱封的袋子中，里面放有 3 X SSC 浸濕的紙巾。
13. 將袋子在 65°C 培養箱中放置 2 h, 關掉培養箱使板子逐漸冷卻。
在培養箱中冷卻板子，可以避免封條上產生冷凝水。
14. 取 1ul 重新懸浮的 PCR 產物，在 2% 瓊脂糖凝膠上分析，如第 3 階段中所述。
充分的沉淀和重懸浮，將產生非常亮的條帶。
15. 裝有重懸浮 PCR 產物的板子，在- 20°C 保存備用。
2. 用熒光測定法對 PCR 產物定量
16. 在熒光測定專用 96 孔板的每個孔中，加入 200ul 熒光劑緩沖液（FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit)。
17. 在熒光測定板的每個孔中，加入 1ulPCR 產物。
18. 在熒光測定板的最后一排，各加 1ul 雙鏈 DNA 標準樣，分別為 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml dsDNA。
19. 設定熒光計激發光為 346nm, 發射光為 460nm。
20. 在 0~500ug/ml dsDNA 的范圍內，測試標準樣是否懸線性的，以及是否可重復。
21. 從所有對照和其他樣品測得的數值中，減去 0ug/ml 樣品的數值后，按照下面的方程
計算 PCR 產物中 dsDNA 的濃度。
22. 根據上面的計算，對于超出預計印刷濃度范圍（0.1~0.5ug/ul) 的 PCR 產物，要調整濃度。
第 5 階段：印制微陣列
完成了前面的方案，研究者將會得到制作微陣列所必需的點樣材料。印制微陣列的方案參數是由所使用的點樣儀和芯片決定的。由于有幾種點樣儀和芯片的組合可以用來制作微陣列，這里不再給出 PCR 產物點樣的詳細方案，可以在其他地方找到（Bowtell and Sambrook 2003)。