實時定量PCR探針概述

實時定量PCR (qPCR)的優勢

?實時檢測PCR反應過程

?精確計算出每個循環的PCR產物量

?擴增和檢測同時進行

?消除后續PCR的干擾

在實時定量PCR反應中，雜交探針與插入染料如SYBR Green相比是更好的選擇。熒光標記探針可以提高實時定量PCR結果的效率、靈敏度和特異性。而且定量PCR可以在一個反應里同時檢測多個目標基因。

實時定量PCR的應用

?基因表達分析

?轉基因檢測和定量

?病原體檢測和定量

?基因型/ SNP分析

?突變檢測

多重PCR分析的優點

?省錢省時省力

?所需樣品量少

?消除移液誤差

?可以在一個反應里設置內部對照

?便于篩選

雙標探針的原理

PCR 擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一線性的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收， PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR 擴增時（在延伸階段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。

兩條線性寡核苷酸探針，其中一條的3 ‘端標記熒光激發基團，另一條的5 ' 端標記熒光檢測基團，在無靶序列的情況下，兩條探針分開，無法進行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測到熒光信號；而當有靶序列時，即在PCR 的退火階段兩條探針與靶序列結合，使得兩條探針上的熒光基團可以進行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測到熒光信號，熒光信號的強弱代表了靶序列的多少。

分子信標技術是在同一探針的兩末端分別標記熒光基團和淬滅基團，為一種標記熒光的發夾探針。在未與模板發生雜交前該探針分子呈發夾結構，結合在其兩端的熒光基團距離上接近，產生能量轉移效應，不發生熒光。當該探針與模板雜交，使熒光基團與淬滅熒光基團彼此在空間上產生足夠的分離，熒光基團脫離了淬滅基團的影響，從而產生可被檢測到的熒光。熒光的強度與溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。

下表列出的是最常用的熒光基團及與之匹配的淬滅基團

由于NED， VIC，PET等熒光素的ZL歸Perkin Elmer公司所有，所以我們推薦以下可替代的熒光素：
Dye Excitation Emission
VIC 538 554
HEX 535 556

NED 553 575
TAMRA 556 580

PET 558 595
RedmondRED 579 595

LIZ 638 655
CY5 646 662

TexasRed 583 603
Cy3.5 588 604

ROX 586 610
Cy3.5 588 604

實驗中常用的淬滅基團
使用無熒光的淬滅基團可以提高實時定量PCR、多重PCR、FRET實驗中的靈敏度。

Dabcyl – Dark Quencher 400–550 nm

分子信標推薦使用Dabcyl淬滅基團。它在抑制藍色至綠色發射光譜的各種熒光染料時非常有效，但是不適合淬滅發射光譜大于480nm的熒光素。

淬滅范圍： 400-550 nm

最大吸光值：453 nm

摩爾消光系數：32.000 M?1 cm?1

分子量：399.2 g/mol

BHQ1 – Dark Quencher 480-580 nm

BHQ1是Biosearch Technologies公司的黑洞淬滅基團之一，對于雙標探針、分子信標和FRET探針非常有效，對綠色至黑色發射光譜中的所有染料都有極好的光譜重疊效應。

淬滅范圍： 480-580 nm

最大吸光值：534 nm

摩爾消光系數：34.000 M?1 cm?1

分子量：491.5 g/mol

BHQ2 – Dark Quencher 520-650 nm

BHQ2 是Biosearch Technologies 公司的第二個黑洞淬滅基團。BHQ2能高效應用于5’端帶熒光的雙標探針、分子信標和FRET探針，有效發射光譜是由深綠色至橙色。

淬滅范圍： 520-600 nm

最大吸光值：544 nm

摩爾消光系數 91.000 M?1 cm?1

分子量：493.5 g/mol

TAMRA – Fluorescent Quencher 520-600 nm

TAMRA (Tetramethylrhodamin)是一種可以用作雙標探針及分子信標的3’端和內部淬滅基團（TAMRA-dT）的熒光染料。它的淬滅范圍適合5’端的報告基團，如FAM, HEX, TET, JOE, Yakima Yellow, Cy3 或者其他這個波長范圍內的染料。在多重PCR中不推薦使用TAMRA，因為它的熒光特性將使淬滅基團和報告基團光譜發生重疊，增加背景干擾。

淬滅范圍: 520-600 nm

最大吸光值: 544nm

摩爾消光系數: 91.000 M?1 cm?1

分子量: 612.7 g/mol

雙標探針和5’核酸酶試驗引物的設計準則

雙標探針 (熒光淬滅探針或稱FQ探針) 在其5’端和3’端分別有一個熒光報告和淬滅基團。利用Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性，這些探針可以用于定量PCR體系。靶序列的特異性探針和特異性的PCR引物同時使用，設計的該探針在上下游PCR引物的范圍內退火。在PCR的延伸階段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性將熒光報告基團從探針上切割下來。隨著PCR循環數的增加，游離報告基團的數量不斷的增加，實時檢測從游離熒光基團上釋放的熒光信號，從而對靶序列進行定量分析。

在設計這些雙標探針的時候需要謹記以下幾個要點。

1、探針的結合位置很重要，先設計好探針再設計PCR引物。

2、探針的結合位點應該靠近擴增產物的中心，擴增產物的長度應該在50-150bp之間。

3、探針的解鏈溫度應該在68℃至70℃之間。

4、探針的長度最少20bp，否則容易發生非特異性結合。

5、盡量避免在探針的5’端出現dG ，因為dG 是一個較弱的淬滅劑，任何dG 都要離5’端至少兩個堿基。

探針的設計標準：

G-C 含量:：30~80%

多聚堿基:：避免出現多個重復堿基，特別是4個或者多于4個G。

末端構成:：在末端不能出現G。

退火溫度:：68-70℃

DNA鏈：挑選C多余G的鏈。如果使用互補鏈，確保C不存在于3’端。

長度:：少于30個堿基。

設計：淬滅基團在3’端，熒光染料在5’端。

引物的設計標準：

G-C含量：30-80%

多聚堿基：避免出現多個重復堿基，特別是4個或者多于4個G

末端組成：3’端的5個堿基中不能多于兩個G或者C，建議A出現在3’端，便于引物二聚體更加高效的降解。

退火溫度:：58-60℃

產物： 50-150 個堿基

設計：在設計完探針之后再設計引物，盡量緊靠探針但是不要發生重疊。其中的一條引物可以和外顯子交接，用于擴增mRNA。

分子信標的設計原則：

分子信標的5’端和3’端也分別有一個熒光報告基團和一個淬滅基團。當熒光染料和淬滅基團接近的時候，探針會形成一個發夾結構。在PCR中，分子信標是特別針對目的基因設計的，分子信標探針可以使PCR引物退火。在PCR的退火階段，探針和它對應的靶序列雜交，發夾環解開后，熒光報告基團和淬滅基團分離，可以發出一個熒光信號。信號的強弱和靶序列的多少成正比，通過實時監測這個信號，可以對靶序列進行定量。為了精確檢測PCR過程，分子信標必須和它們的靶序列在退火階段雜交成功，而游離的分子信標應該繼續保持封閉狀態，不會發出任何熒光。通過適當選擇探針的長度和靶序列的長度，當溫度高于退火溫度7-10℃時，探針能夠從靶序列上脫離下來，這樣的探針序列的長度就很適宜。探針與靶序列的解鏈溫度可以用“GC百分比”原則預測，很多設計探針的軟件包都使用這個原則。在添加莖環區序列之前，這個預測方法只能用在探針序列的設計上。實際應用中，探針序列的長度范圍通常是15-30個核苷酸。

上圖顯示的是分子信標在實時定量PCR中的應用原理

A：不和靶序列結合的時候，分子信標呈現發夾結構。熒光報告基團和淬滅基團的緊密結合阻止了報告基團釋放熒光。
B：在PCR的退火階段，分子信標和靶序列雜交結合，將熒光染料和淬滅基團分離，導致熒光染料釋放信號。信號的強弱和靶序列的多少成正比，實時監測熒光信號可以對靶序列進行定量。

?莖環區的解鏈溫度比退火溫度高7~10℃

?探針的環狀區需要15~30堿基

?莖環區的兩邊長度應該在5~7 堿基之間

?擴增產物的長度少于150 bp