實用哺乳動物細胞培養手冊（四）

細胞培養無菌操作基本技術

無菌操作技術分為三個部分：工作環境及表面的處理，細胞培養所用玻璃及塑料制品的處理及培養液與培養細胞的處理。

工作環境的處理 使用層流超凈工作臺是最經濟有效的手段。超凈工作臺正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超凈臺。

（1）實驗前，無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射 30-60 分鐘滅菌，用 70% 酒精擦拭無菌 操作臺面，并開啟無菌操作臺風機運轉 10 分鐘后，才可開始實驗操作。每次操作只 處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。實驗結束后，將實驗物品帶出工作臺。如需 要繼續進行下一個實驗，則用 70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風機運 轉 10 分鐘后，才可進行下一個實驗操作。

（2）無菌操作工作區域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以 暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通。實驗用品要用 70% 酒精 擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在操作臺中央無菌區域內進行，勿在邊緣 非無菌區域操作。

（3）小心取出無菌實驗用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要 在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。

（4）工作人員應注意自身的安全，必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性 或病毒感染的細胞株應特別小心，并選擇適當等級的無菌操作臺（至少兩級）。操作過 程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖 銳物品傷人等。

（5）定期檢查下列項目：CO2 鋼瓶內的 CO2 壓力；CO2 培養箱內的 CO2 濃度、溫度、及水盤 是否有污染；無菌操作臺內氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及 HEPA 過濾器濾膜， 預濾網 ﹙300 小時/預濾網，3000 小時/HEPA）。

培養細胞生長過程：潛伏期→指數增生期→停滯期

潛伏期 (latent phase)

細胞接種后, 先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期. 此時, 細胞質回縮, 胞體呈圓球形. 然后細胞貼附于載體表面, 稱貼壁, 懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類, 培養基 成分, 載體的理化性質等密切相關。一般情況下，原代培養細胞貼壁速度慢, 可達 10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常 10-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期. 原代培養細胞潛伏期長，約 24-96 小時或更長, 連續 細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需 6-24 小時。

(2) 指數增生期 (logarithmic growth phase)

這是細胞增殖最旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為 判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數（Mitotic index, MI）表 示，即細胞群中每 1000 個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于 0.1%-0.5%，原 代細胞分裂指數較低，而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達 3％－5％。指數增生期 的細胞活力最好時期，是進行各種實驗最佳時期，也是凍存細胞的最好時機。在接種細 胞數量適宜情況下，指數增生期持續 3－5 天后，隨著細胞數量不斷增多、生長空間減少， 最后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現象稱接觸抑 制現象 (contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象，能繼續移動和增殖，導致 細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發生接 觸抑制，但只要營養充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數仍然在增多。但是，當 細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養枯竭和代 謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現象稱密度抑制現象（Density Inhibition）。

（3）停滯期 (Stagnate phase)

細胞數量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時 細胞數持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如 不進行分離傳代，細胞會因培養液中營養耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒，出 現形態改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發生死亡，因此，應及時傳代。

培養細胞基本形態

培養細胞隨貼附支持物形狀不同而形態各異，最常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的，結構不明顯。細胞在生長期常有 1-2 個核仁。在細胞機能狀態不良時，細胞輪廓會增強，反差增大。若胞質中時而出現顆粒、脫滴和腔 泡等，表明細胞代謝不良。

體外培養細胞根據它們在培養器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生 長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養時能貼附在支持物表面生長。如羊水細胞為貼 附型細胞，常表現為成纖維型細胞和上皮細胞生長。懸浮型細胞在培養中懸浮生長。

（1）成纖維型細胞 在培養中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長，細胞中央有卵園形核，胞質向外伸出 2-3 厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外， 凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長。

（2）上皮型細胞 此類型細胞在培養器皿支持物上生長具有扁平不規則多角形特征，細胞中央有園形核，細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養時，皆呈上皮型形態生長。

（3）游走型細胞 本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質經常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規則。此型細胞不很穩定，有時亦難和其它型細胞區別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯成片后，可呈類似多角型或成纖維細膩包形態。常 見于羊水細胞培養的早期。