固相萃取的操作原理是將液態或溶解后的固態樣品倒入活化過的SPE柱，然后利用抽空或加壓使樣品進入SPE柱的固定相。利用固定相和樣品組分間的相互作用實現對目標組分的富集和對樣品基質的去除。為提高處理效率，可以采用SPE歧管真空裝置同時處理多個樣品。一般地，SPE在分離步驟中保留感興趣的組分和類似的其他組分，并盡量減少不需要測定的樣品組分的保留。弱保留的樣品組分可用一種溶劑沖洗掉，然后用另一較強溶劑把感興趣的分析物從固定相上洗脫下來。有時根據樣品和固定相作用強度不同，也可以讓感興趣的組分（分析物）直接通過固定相而不被保留，同時將大部分干擾物保留在固定相上，從而實現分離凈化的目的。但在多數情況下，使分析物得到保留更有利于樣品的凈化。
SPE小柱是進行SPE處理的核心部件。一個SPE小柱由三部分組成：柱管、燒結墊、固定相，柱管一般做成注射器形狀，多由血清級的聚丙烯制成，一些廠家也提供玻璃柱管。柱管下端有一突出的頭，此頭的尺寸已標準化，可用于各種不同的SPE歧管真空裝置。燒結墊除了能固定固定相外，也能起一些過濾作用。聚乙烯是常見的燒結墊材料，對于特殊樣品也可使用特氟隆或不銹鋼片。固定相是SPE柱中最重要的部分最常見的SPE固定相是鍵合的硅膠材料，采用不規則形狀、孔徑60A（1A＝0.1nm，下同）、粒徑40μm的硅膠粒作為原材料，然后用各種硅烷將官能團鍵合上。此外也有一些非硅膠基的固定相可供選用。
固定相的色譜特性決定了可被保留的組分和保留的強度，固定相的選擇是發展SPE方法的最重要因素，它不僅取決于目標分析物質和樣品基質，也受樣品溶劑影響。
選擇最佳固定相時，須考慮以下幾點：
（1）目標組分在極性或非極性溶劑中的溶解度；
（2）目標組分有無可能離子化，從而決定可否使用離子交換固定相；
（3）目標組分有無可能與固定相形成共價鍵；
（4）雜質組分與目標組分在固定相結合點上的競爭程度。
分析物的極性與固定相極性非常相似時，可使目標組分得到最佳保留。兩者極性越相似，保留越好。所以要盡量選擇極性相似的固定相。例如，萃取碳氫化合物（非極性）時要采用反相柱（非極性）。而當分析物極性適中時，正、反相固定相都可使用。
固定相選擇還受樣品溶劑制約。樣品溶劑強度相對固定相應該較弱。弱溶劑會增強分析物在固定相上的保留。如果溶劑太強，目標組分將得不到保留或保留很弱。舉例來說，樣品溶劑是正己烷時，用反相柱就不合適，因為正己烷是強溶劑，分析物無法在柱上保留；當樣品溶劑是水時，就可以用反相柱，因為水是弱溶劑，不影響分析物的保留。
表1列出了目前常用的SPE固定相及其保留機理，以供參考。每根SPE小柱的固定相質量一般為100mg、200mg、500mg或1000mg。為保證滿意的樣品凈化效果和充分的保留，處理臟的、復雜的或高濃度的樣品時應采用固定相質量較大的小柱。
固定相 | 簡稱 | 主要機理 | 次要機理 | Si-OH活性 |
Ethyl（乙基） | C-2 | 非極性/極性 | —— | 陽離子交換 |
Octyl（辛基） | C-8 | 非極性 | 極性 | 陽離子交換 |
Octadecyl（十八烷基） | C-18 | 非極性 | 極性 | 陽離子交換 |
Cyclohexyl（環已烷基） | CH | 非極性 | 極性 | 陽離子交換 |
Phenyl（苯基） | pH | 非極性 | 極性 | 陽離子交換 |
Cyanopropyl（氰基） | CN | 非極性/極性 | —— | 陽離子交換 |
Diol（二醇基） | 2OH | 非極性/極性 | —— | 陽離子交換 |
Aminopropyl（氨丙基） | NH2 | 極性/陰離子 | 非極性 | 陽離子交換 |
Silica（未鍵合硅膠） | Si | 極性 | —— | 陽離子交換 |
Primary Secondary Amine（n丙基乙二胺） | PSA | 極性/陰離子 | 非極性 | —— |
Benzensulfonylpropyl（苯磺酰丙基） | SCX | 非極性/陽離子 | 極性 | —— |
Sulfonylpropyl（磺酰基丙基） | PRS | 陽離子交換 | 極性/非極性 | —— |
Carboxymethyl（羧甲基） | CBA | 陽離子交換 | 極性/非極性 | —— |
Diethylaminopropyl1（二乙基胺丙基） | DEA | 極性/陰離子 | 非極性 | 陽離子交換 |
TrimethylaminopropyI（三甲基胺丙基） | SAX | 陰離子交換 | 極性/非極性 | 陽離子交換 |
表1 常用的SPE固定相極其保留機理
而對于體積較大的液相樣品，如水樣分析，還可用儲樣器，連接在柱管上方以增加sPE容積，能在很大程度上提高一次上樣量（可達75～100mL）。
SPE方法一般有四個基本操作步驟:固定相活化、樣品上柱、淋洗和分析物洗脫。活化的目的是創造一個與樣品溶劑相容的環境并除去柱內所有雜質。上樣步驟指的是樣品加入到SPE柱并迫使樣品溶劑通過固定相的過程這時分析物和一些樣品干擾物保留在固定相上。
為了保留分析物，溶解樣品的溶劑必須較弱。分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的樣品組分。淋洗溶劑總是略強于或等于上樣溶劑。淋洗溶劑必須盡量地強以洗掉盡量多的不需要的組分，但不能強到可以洗脫任何一個分析物的程度。淋洗過后，將分析物從固定相上洗脫。洗脫溶劑用量一般是0.5～0.8mL/100mg固定相。這時必須認真選擇溶劑：溶劑太強，一些更強保留的不必要組分將被洗出來；溶劑太弱，就需要更多的洗脫液來洗出分析物，SPE柱的濃縮功效就被削弱了。表2中列舉了SPE方法中常用的溶劑以及它們的洗脫強度，以供參考。收集起來的洗脫液可以直接向色譜柱進樣，也可以把它濃縮后溶于另一溶劑中來進樣或以其他方式進行進一步凈化。
正相 | 反相 | |
己烷 | 弱 ↓ 強 | 水 |
異辛烷 | 甲醇 | |
甲苯 | 異丙醇 | |
氯仿 | 乙腈 | |
二氯甲烷 | 丙酮 | |
四氫呋喃 | 乙酸 | |
乙醚 | 乙醚 | |
乙酸 | 四氫呋喃 | |
丙酮 | 二氯甲烷 | |
乙腈 | 氯仿 | |
異丙醇 | 甲苯 | |
甲醇 | 異辛烷 | |
己烷 |
表2溶劑強度列表
因為方法步驟較多，且影響萃取結果的因素也較多，發展一個成熟的SPE方法必須進行參數優化。優化過程中必須考慮的因素包括固定相的選擇，洗脫溶劑的選擇，柱容量，以及洗脫流速等。一個好的SPE方法能對特定的復雜基質中多個目標組分同時實現可靠的定量回收并有一定的穩健性，適合在不同實驗室間進行推廣。
經過十幾年的快速發展，SPE方法的商品化程度相對較高，有多種適用于不同樣品基質不同目標組分的SPE小柱以供選擇，且價格較低。雖然SPE小柱不能反復使用，總體來說，樣品預處理方法的成本仍可以接受。對于典型應用領域，已經發展出一些標準化方法，省卻了用戶自行發展SPE方法的步驟。一些應用實例請見參考文獻。讀者也可根據具體需求查閱文獻、技術說明和應用報告，獲取更多方法細節。