Geltin（明膠）包被
準備500ml 0.1％geltin溶液
1．將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2．最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22 μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養板或培養皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面（15 cm培養皿加2ml，10 cm培養皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養表面就行了。）；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養板。
細胞傳代
建議每2天傳代細胞一次，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前，通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。
1．去除培養液；
2．無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；
3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。
4．加入ES培養基使胰酶失活；
5．將細胞轉入15 ml離心管中離心3min；
6．去除上清，將細胞重懸于2 ml ES培養基，至少吹打10－20次。
如果加入培養基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。
7．將細胞接種在沒有包被的組織培養皿中（使用和一開始同樣規格的培養皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內將黏附，而ES細胞仍將保持懸浮）；
8．將含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開（前面已經提到--ES細胞有聚集成團的傾向）
9．建議按1：4－1：10的比率傳代 (ATCC)
保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規格的培養板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。
體外分化
胚胎干細胞在體內外可以分化為各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利于神經前體細胞通過在最少量的培養基內選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴增（第4步）并最終分化在第5步。細胞全程培養在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。一般體外誘導向神經細胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進行誘導。
時間線（總時間為27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天
體外向心肌細胞方向分化
胚胎干細胞在體外去除LIF情況下會自然向心肌細胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出現搏動的心肌細胞，與胚胎發育時間線是完全一致的。
培養基
EB
配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（該溶液也能用于ES培養基--見前述）。分裝在50ml
離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml
FBS加入450mlDMEM中制備培養基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
貯存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg/ml