工業微生物產生菌的分離篩選（四）

各種微生物對營養要求和培養條件是不同的,在分離篩選時若在這兩個方面加以調節控制,就能獲得更好的分離效果.

1. 培養基的營養成分

    各種微生物對碳源、氮源要求各異,有的對營養還有特殊的要求,事先了解被分離微生物的營養要求,從而設計一個合理快速的分離培養基,能夠收到事半功倍的效果.

放線菌是生產抗生素和酶制劑的重要來源.在選擇分離放線菌時,通常采用改良的HV瓊脂培養基、土豆-胡蘿卜水汁液培養基和淀粉瓊脂培養基能取得較好的效果.但不同菌種對營養要求差別很大,如奴卡氏菌在有氧條件下用普通培養基即可分離到,而以色列放線菌則在有CO2存在且有適宜培養基的情況下才能正常生長繁殖.

篩選水解酶產生菌時,通常利用以底物為惟一碳、氮源的平板進行分離,如以淀粉為碳源的培養基可鑒定菌落能否產生淀粉酶；一種含纖維素粉為碳源的分離培養基,可以鑒別纖維素酶產生菌；用含有酪蛋白為有機氮源的平板培養基,可以鑒別蛋白酶的產生菌.純種分離時,把以上瓊脂平板置于適宜的溫度培養一定的時間,如具有產生水解酶能力的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,根據圈的大小可初步判斷酶活力強弱.測定水解圈直徑與菌落直徑之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供進一步篩選.

2. 培養基的pH

    細菌、放線菌的生長繁殖對pH一般要求偏堿,霉菌和酵母菌要求偏酸.因此,分離培養基的pH應該調節到被分離微生物要求范圍.這不僅有利于自身生長,也可排除一部分不需要的菌類.例如,分離檸檬酸產生菌的黑曲霉,就是利用調節培養基的酸堿度獲得成功的.其分離方法是：取紅芋粉醪20%、檸檬酸 10%～20%配成培養液,調節pH2.0～2.5,以一定量的培養基和土樣均勻混合,用毛細吸管點種在平皿內事先覆蓋的無菌濾紙上（2～3層）,于 30℃培養,這樣可以分離到產生檸檬酸的黑曲霉.

分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產生菌時,可以把培養基調到pH9～11,在此范圍內不宜生長的微生物被抑制,這對分離本身起到濃縮作用.大多數水解酶的生長最適pH基本相近,而酶的作用pH未必與產酶pH相同.

    培養基的pH要結合營養成分和培養條件來考慮.因為微生物在生長繁殖過程中,由于代謝作用會產生酸性或堿性產物,pH發生變化,微生物生長受到抑制.一般培養基中碳氮比（C/N）高者,培養后傾向于酸性,反之則傾向于堿性.無機鹽的性質也會影響pH變化,（NH4）2SO4是生理酸性無機氮源,其中NH4+被菌體利用,留下SO42-,培養液變成酸性.而NaNO3是生理堿性氮源,其中NO3-被菌體分解利用后,剩余Na+,使培養液變成堿性.如發酵過程缺氧,則代謝向有機酸合成方向進行,pH下降.為了維持培養基的PH,一般要加磷酸鹽,如K2HPO4、KH2PO4,使培養基具有一定的緩沖能力.如果培養液中的酸堿變化很大,磷酸鹽的緩沖容量不足以調節pH變化,則可適當加入碳酸鈣,以不斷中和菌體代謝過程中產生的酸類,使培養基的pH能保持在恒定的范圍內.此外,在分離霉菌時,加幾滴乳酸不僅可以維持一定酸堿度,而且可以抑制細菌的生長.

3. 排除不需要的菌類

    采取調節pH的方法來抑制非目的微生物的生長,雖然能起到一定的作用,但并不是對所有的菌類都有效.有些細菌和放線菌同樣可以在酸性環境下生長,而個別的霉菌,也同樣可以在中性或偏堿的培養基中生長.為了更有效地抑制非目的微生物的生長,要加入一些專一性的抑制劑.

（1）分離細菌時,在培養基中加入濃度為50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生長.

（2）分離放線菌時,在樣品中加入0.05%十二烷基磺酸鈉（SDS）不僅可以抑制細菌的生長,還能激活放線菌孢子的萌發.加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制細菌和真菌,而不影響放線菌的生長.

（3）分離霉菌和酵母菌時,在培養基中加入青霉素、鏈霉素和四環素各30U/ml,可以抑制細菌和放線菌生長.

（4）分離根霉和毛霉時,由于這些微生物的菌絲易蔓延成片,難以得到純化的菌落,通常在培養基中添加0.1%去氧膽酸鈉或山梨醇防止菌絲蔓延,使菌落長得小而緊密.

  一般用于分離單一目的微生物的培養基中均含有抑制其他微生物的抑制劑,這些專用的抑制劑在小型實驗室配制較麻煩,現已有成品供應,只要直接加入基礎培養基即可.如氨芐西林,主要用于分離親水氣單孢菌.

4. 控制培養溫度

    控制培養溫度,也是一種獲得目的微生物的有效措施.各類微生物生長溫度不同,從大范圍來看,可分三大類：一類是高溫微生物,最適溫度在50～60℃.如果要分離這類菌可將分離培養基置于50～60℃溫度下培養,能抑制一些嗜冷、中性微生物生長,可以有效地分離到高溫菌類.第二類是中溫微生物,它們的最適生長溫度是20～40℃,超過50℃,就停止生長.這類微生物最為常見,、數量都占首位.工業發酵微生物絕大多數都屬于此類.其中不同類群微生物對溫度又有所差別,一般細菌、放線菌最適溫度為25～37℃,霉菌和酵母最適溫度為20～28℃.第三類為低溫微生物,它們的最適溫度為15℃或更低.當從樣品中分離各種菌類時,分別置于自身最適溫度下培養也可大體上抑制另一些微生物的生長.當分離某些特殊產物的微生物時,對溫度的選擇還需考慮某些內在的關系,如在篩選不飽和脂肪酸產生菌時,由于細胞膜中所含的不飽和脂肪酸含量越高,其凝固點越低,即細胞在較低溫度下仍能表現出活力,因此在低于正常溫度10℃下分離效果最好.