常見組織細胞的培養方法（一）

體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術措施亦不盡相同，現介紹個別組織細胞培養的要點如下:

*節 上皮細胞培養

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞，培養時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。

體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

以表皮細胞為例，用皮膚表皮和分離培養法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

6、反復吹打，制成懸液。

7、培養：用80目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。

第二節 內皮細胞培養

內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。

研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡便，其法如下：

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養，可于12小時內保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。

5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

第三節 神經細胞培養

神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象，但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自發轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

一、設備： 無菌操作設備。

二、大型設備CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡，用于準確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。 

高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術器械。

過濾器：配制解剖液、培養液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。

滲透壓儀，pH劑，天平等。

三、培養器皿及手術器械

1、培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2、培養板，24-40孔，可用于開放培養。

3、培養瓶：

4、吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5、各類培養液貯存器。

6、小型手術器械。

準備：

一、配制培養液

（1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。

（4）維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養物質。

二、培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠

三、消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進行。

神經細胞分散培養

（一）選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。

（二）取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。

（三）細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

（四）抑制膠質細胞生長。培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。

（五）觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質細胞增生明顯，7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面，形成地毯，2周時神經細胞生長zui豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經細胞開始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周zui宜。

但神經細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養時間的延長，細胞數量在下降，但膠質細胞可以，神經膠質細胞也可以。在培養過程中，早期9-12d時，有較多的神經細胞死亡，這是*次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。

（六）常用培養細胞實驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析；

但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核內抗原定位時，首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。

在免疫組化中，或其它組織學染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯；GFAP對星形膠質細胞具有特異性染色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以往多被忽視，其在腦血管疾病（如缺血性損傷）、退行性疾病（如AD、PD）、損傷后膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經細胞功能和營養支持的物質基礎。