3.5 DNA 混編和隨機突變
逆轉由末端截切或刪除突變造成的結構干擾的關鍵優化步驟是在遺傳水平上建立高度可變的突變庫。隨機突變與 DNA 重組的結合能夠滿足這樣的突變需求。
DNA 混編 [ 15，16 ] 是在試管里進行 DNA 重組的廣泛應用的方法。由 DNA 混編方法將不同源的基因混雜在一起是定向進化中的關鍵步驟，其主要特點簡述如下：在全基因上進行隨機點突變后，主要是由易錯 PCR ( 見 16.3.7 ) 引入突變得到的突變庫可用來 DNA 片段化，從而得到小的、略微不同的、可相互交換的、長度為 50~200 個堿基對的 DNA 片段。將一個或多個核苷酸不同的同源序列交迭并用 PCR 重新擴增成長片
段，起初用低溫退火來確保最小的片段也能夠進行 PCR。隨著循環次數的增加，將退火溫度逐步提髙來選擇長的交迭片段。最后，用基因兩側的引物合成全長的基因，并引入合適的酶切位點進行下一步的克隆。
以下內容介紹用易錯 PCR 和 DNA 混編來創建有足夠復雜度、多樣化的突變庫。值得注意的是，這里介紹的步驟只針對我們的系統，隨著目標基因的長度和組成需要有所改變。需要考慮在易錯 PCR 引進突變之前反應的覆蓋率，第一次隨機突變，第二次組合是不能用來決定混編過程中的錯誤率的（見注 2 )。
( 1 ) 得到足夠量（5~10 μg）的目標基因，可用目標基因兩端的同源序列 PCR 或者用限制性內切核酸酶基因末端剪切。如果用 PCR 方法，應該用 Taq DNA 聚合酶來合成產物。在我們的例子中，我們以 pKJE_Bla_N△5 為模板，用引物 Pr_sfi_pelB_DG_ shuffl 和 Pr_GG_his5 _ hind_shuffl 擴增截切的 β-內酰胺酶。
( 2 ) 將 4~5 μg 的目標基因用 0.2 U 的 DNase l 在 50 μl DNaSe I 的酶切體系中，于室溫（25°C) 下酶切 12 min。
( 3 ) 加入 4 μl 的 EDTA 溶液終止內切酶反應，并在冰上放置。
( 4 ) 將得到的 DNA 片段在 2% 的瓊脂膠上分析并回收長度為 50~150 bp 的 DNA 片段。
( 5 ) 用 Qiaex II 膠回收試劑盒回收 DNA 片段（見注 3)。
( 6 ) 在 50 μl 體系中，加入約 100~300 μg 的純化的片段用來作引物延伸 PCR ( 見注 4)。反應混合物包括 2.5 U DNA 聚合酶、0.4 mmol/L dNTP 2 mmol/L MgCl2。在 PCR 儀（Eppendorf) 中，PCR 反應用以下程序進行：94°C 3min；94°C 1 min ( 變性），（ 45 + 0.3 )°C 每個循環 1 min (退火），72°C 1 min (延伸）（10 個循環）；最后一個循環后 72°C 5 min；94°C 1 min，（50+0.4)°C 每個循環 1 min，72°C 1 min (15 個循環）；最后一個循環后 72°C 5 min；94°C 1 min，（56+0.5)°C 每個循環 1 min，72°C 1 min (10 個循環）；最后一
個循環后 72°C 5 min；94°C 1 min， ( 61 + 0.5 )°C 每個循環 2 min，72°C 2 min (10 個循環）；最后一個循環后 72°C 5 min。另外，一個簡單程序，如 94°C 3 min，35 個循環：92°C 30s，(30 + 1 )°C 每個循環 1 min ，72°C 1 min + 4s/循環，最后一個循環后 72°C 5 min。
( 7 ) 擴增 1/5 體積的重疊的 PCR 反應物（不需要純化）來擴增全長基因，并加入合適的酶切位點以便下一步克隆。這步可在易錯傾向條件下進行，以便擴增突變庫的多樣化。除了用 Taq DNA 聚合酶延長外，擴增反應的突變率可通過 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2 的加入而提高( 見注5)。在我們的例子中，我們用引物 Pr_sfi_
pelB_DG_shuffl 和 Pr_GG_his5_hind_shuffl，每條引物的濃度是 0.5 μmol/L。反應混合物包括 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2、0.4 mmol/L dNTP 和 2.5U Tag。所用的程序是 94°C 3 min，25 個循環：94°C 1 min , 68°C 1 min，72°C 1 min，最后一個循環后 72°C 7 min。
( 8 ) 用 GFX PCR DNA 和切膠回收試劑盒來純化 PCR 產物，用合適的酶酶切產物，克隆到表達載體中。用16.3.6 所述方法進行轉化。
我們進行了 3 個循環的定向進化（S1~S3)，用 DNA 混編和隨機突變并結合體內篩選過程。所得到的克隆被收集，作為下一步進化的模板。在定向進化的最后一個循環中，DNA 混編后的易錯 PCR 被標準的 PCR 程序取代，防止在重組的克隆中產生有害突變。
16.3.6 轉化及在體內篩選突變庫
( 1 ) 把質粒突變庫，用丁醇沉淀。用 10~20 μl 連接混合物，加入雙倍量的去離子水使體積達到 50 μl。加入 500 μl 丁醇在室溫離心 2000 g，30 min。去掉上清液，在室溫晾干，加入 10~20 μl 的水。
( 2 ) 將沉淀后的 DNA 加入到 100 μl 電轉感受態 E.coli XL-1 藍細胞中。1.7 kV，200Ω，25 μF。轉化完后立即加入 900 μl 的 2YT 培養基和 1/100 體積的轉化鹽儲液。
( 3 ) 將懸浮的細胞加入 10 ml 玻璃試管中，在 37°C 培養 60~70 min。
( 4 ) 通過將轉化產物逐步稀釋涂在 LB/Cm 板上來檢測轉化效率。
( 5 ) 用另一管轉化的細胞涂在不同濃度的氨芐抗性 LB/Cm 板上來檢測篩選壓力( 見注 6)。選擇在最高氨芐濃度下長出來的突變體來進行下一步實驗。
( 6 ) 作為篩選，把轉化的細胞涂在不同濃度的氨芐抗性 LB/Cm 板上 [ 由步驟（5 )得到的濃度 ] ( 見注 6 )。我們用的氨芐在第一到第三次篩選的濃度分別為 20 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml。第一次的篩選是在液體培養基中進行，后兩次篩選是在固體培養基上。
突變體 N△5 經過 3 個循環的定向進化（包括隨機突變和 DNA 混編）（見 16.3.5)，被損功能得以恢復。在這 3 個循環中得到 19X103 個，147X103 個和 260X103 個的克隆，分別在 20 μg/ml，100 μg/ml 和 200 μg/ml 氨芐抗性板上生長 [ 步驟（6 )]，得到 3600~7000個克隆。
表 16.1 總結了所有在 3 個混編循環（S1~S3 ) 的定向進化中得到的克隆的測序結果。另外，表 16.1 還包括了每個野生型殘基的相對溶劑可接觸性和平均側鏈原子溫度因子（由 PDB 1btl )[ 37] 。其中在第二個循環后的 5 個突變體有兩個突變，M182T 和 T265M ( 根據 Ambler et al. 命名，這兩個突變在第一次循環后已經存在。
經過最后優化步驟，收集突變庫，在不用 IPTG 誘導的情況下，決定最大氨芐抗性濃度，見 16.3.4 ( 圖 16.3)。能長出顯著數目的克隆數的抗性是 700 μg/ml，經過 40 h 的培養，克隆可在含 1000 μg/ml 的抗性上生長。相比，野生型只能在 500 μg/ml 的抗性上生長。從含 800 μg/ml 和 1000 μg/ml 的抗性板上挑取 26 個克隆，并測序。26 個克隆屬于 15 個不同的突變體（表 16.1)。所有的克隆有兩個共同的突變位點，M 182T 和 A224V。以
前的研究表明 M182T 突變體能夠互補折疊缺陷 [39] 和穩定性缺失 [ 29，40 ]。突變體 A224V 在第三次循環中提高選擇壓力。這個突變體曾經被提到過，但并沒有實驗數據證實 [41]。
兩個突變體離截切的位點有 17A 的距離，表明是由截切引起的結構干擾的獨立互補。圖 16.4 是對 TEM- 1β-內酰胺酶最常用的一些突變殘基。通常，在單獨優化的突變體中矢變在在在整個結構中分布，而不是局部聚集在一起。