| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
乙酸銨（10mol/L)
ATP
乙醇
甘油（無菌，100%)
水（去離子蒸餾水）
IPTG
MgCl2
NaCl
酚（pH7.6 Tris 飽和）
酚：氯仿（1:1,m/V)
聚乙二醇（30% m/V PEG 8000) 溶于 2.5mol/LNaCl
可選用，參見步驟 1
聚乙二醇（20% m/V PEG 8000) 溶于 2.5mol/LNaCl
TE(pH7.6)
10XTM 緩沖液
0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)
150 mmol/LMgCl2
TTE 緩沖液
含 0.5%Triton X-100TE(pH8.0)
X-gal
酶和緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶
T4 噬菌體 DNA 聚合酶
T4 噬菌體多核苷酸激酶
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
凝膠
瓊脂糖凝膠（兩種 1% 和一種 0.7%)
聚丙烯酰胺凝膠（中性，5% 聚丙烯酰胺）或瓊脂糖凝膠（0.8% 低熔點瓊脂糖）
核酸和寡核苷酸
λ噬菌體 DNA 或Φ174DNA 用 Alu I[1ug Alu I, 溶于 20ul TE(pH7.6)]完全酶解]。
酶解后，用等體積酚: 氯仿抽提 DNA, 去除限制性內切核苷酶。乙醇沉淀 DNA 重溶于 TE(PH7.6) 中，按步驟 13 測試酶解 DNA 與去磷酸化、線性化栽體的連接效率。如采使用商品化的栽體就不需要消化 DNA 了。
DNA 分子質量標準
適當大小的 DNA 分子質量標準，如 Life Technologies 公司用 Sau3AI 消化的 PUC18pUC19DNA, 或相差 123bp 的梯度分子質量標準；New England Biolabs 用 Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA。
dNTP 溶液，含有 4 種 dNTP, 每種濃度為 2.0 mmol/L
靶 DNA
靶
DNA 制備通常由用限制酶消化高容量栽體（如：黏粒栽體、BAC、PAC 或 P1)
構建的重組體獲得。所用限制酶的酶切位點應在克隆片段的序列中不存在。如果可能盡量使用能產生黏性末端的限制性酶，這可以簡化純化的粑 DNA
的連接（步驟 1)。靶 DNA 片段從載體中酶切下來后，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化（請參見第 5 章的方案 6 或 7)。用 TE(pH7.6)
溶解純化的 DNA，濃度為取 DNA 溶液（50ng)，用瓊脂糖凝膠電泳檢査 DNA 的完整性和回收率。
培養基
LB 或含有 5 mmol/L MgCl2 的 2xYT 培養基
頂層瓊脂糖
YT瓊脂平板
離心機和轉子
轉速3000r/min離心深孔微量板和標準微量滴定板的離心機。
例如配備微孔板架的貝克曼GPR離心機，配備擺式轉頭（M4型）和微孔板架的JocanCR422型離心機。
專用設備
深孔微量板、蓋、帽
微孔要能容納1~1.2
ml, 并能經受住3000r/min的離心。如96孔平底板（DBM Scientific,San
Fernando,California)和蓋子（V3-Verl-Tips-Cover,Ulater Sciemifici購自Baxter
Inc.，McGaw Park,Illinois)。此外，還有配有單片蓋和帽的貝克曼96管盒。制備96個M13噬菌體模板需要兩盒配有蓋和帽的管。
微量滴定板（96孔，配有合適的蓋）
參見信息欄有關微量滴定板部分。
多頭移液器（8或12個頭）
多管渦旋振蕩混合器
銀色膠帶（3M公司產品）或相應物品
膠帶必須確保96管盒密封不漏水。在美國和墨西哥R.S.Hughes公司（http://www.rshughes.com)提供3M公司的銀色膠帶。
超聲儀或噴霽器
關于超聲，可以用微型探頭超聲儀或杯-角型超聲儀。本方案中推薦使用杯-角型超聲儀（如配備CL4杯-角型探頭的XL2015型超聲儀，Heat
Systems產品)，有兩點理由：1.DNA置于微量離心管中，體積通常只有20--25ul;2.
因為杯-角杯型超聲儀探頭不接觸DNA溶液，沒有污染。關于噴霧器，對一次性的治療用噴霧器進行改造的方法見附錄8。
牙簽
可調節16°C、37°C、68°C和80°C的水浴。
載體和菌株
M13噬菌體載體 DNA，包括藍白篩選、線性化、平末端和去磷酸化的載體DNA。
這些種類的預制栽體DNA可以從公司購得，也可以按照本方案后面提供的附加方法制備。
適當菌株的大腸桿菌感受態細胞（如XLIF'-Blue、DH5aF')
高效的大揚桿菌感受態細胞（>109
轉染子/ug 閉環栽體DNA) 對獲得高豐度的靶 DNA 庫是十分重要的。預制備的高效大腸桿菌感受態細胞可以從公司購得，也可參照第 1
章的方法 23~26 制備。如果使用電轉移儀，我們推薦使用電轉大腸桿菌感受態細胞，可以獲得高效轉化。
方法
靶 DNA 自身連接
自身連接是確保耙 DNA 末端序列在構建文庫的片段中有足夠的量所需要的。
1. 將 5~10 g 純化的靶 DMA 加入一只干凈的離心管中，并加入:
10XT4 噬菌體 DNA 連接酶緩沖液 2.5ul
5 mmol/LATP 2.5ul
30%m/V PEG8000(可選加） 5.0ul
T4 噬菌體 DNA 連接酶 0.5~2.0Weiss 單位
H20 至終體積 25ul
混合液于 16°C 溫育 4 h, 然后于 68°C 加熱 15 min 使連接酶失活。
如果靶 DNA 是平末端，在反應中加入 PEG 可以提髙連接效率，黏末端連接，連接酶用量為 0.5Weiss 單位；平末端連接，連接酶用量為 2.0Weiss 單位。
有些商品連接酶緩沖液中含有 ATP, 此時無須添加 ATP。
2. 加入 175ul TE(pH7.6), 用酚: 氯仿抽提以純化連接好的 DNA。用 2mol/L 乙酸銨和 3 倍體積乙醇沉淀 DNA，用微量離心機以最大轉速離心 5 min, 回收 DNA。于室溫用 0.5 ml70% 乙醇洗滌沉淀，再次離心。
3. 盡可能去除上清液，在室溫下使最后殘留的痕量乙醇揮發殆盡。在微量離心管中加入 25ul TE(pH7.6) 溶解 DNA。
靶 DNA 的斷裂
下列方法是 Birren 等（1997) 方法的改進。
4. 用超聲處理或噴霧處理使粑 DNA 斷裂為 0.8~1.5kb 長的片段（參見表 12-1)。
超聲斷裂 DNA(參見圖 12-3)
a. 在超聲儀的角杯中注滿冰水，打開超聲儀開關. 設置好時間，功率設為 10, 用兩次 40 秒脈沖預熱超聲儀。
冰水可以防止 DNA 變性，超聲不同樣品前最好更換角杯中的冰水。
b. 將裝有 DNA 的離心管放置于冰水中，離心管的底部恰好高于角杯探頭中心孔 1~2 mm，超聲處理 DNA(參見圖 12-3)。
通過超聲處理試驗樣品 DNA, 并用步驟 4 描述的方法分析超聲結果，確定最適超聲處理條件。對于大多數 DNA 樣品，功率設為 3, 兩次 6 秒脈沖主要產生 500~2000bp 大小的片段。
c. 快速離心使超聲處理的 DNA 溶液沉積于離心管底部，并置于冰上。
d. 取 lul 超聲處理的 DNA 樣品和適當大小的 DNA 分子質量標準，用 0.7％ 瓊脂糖凝膠電泳分析 DNA 片段大小。電泳時余下的 DNA 樣品仍放置在冰上。
如果得到的 DNA 片段大小不合適，改變超聲條件，再次進行超聲處理。如果得到的 DNA 片段大小合適，繼續按步驟 5 所述進行 DMA 末端修補。
噴霧斷裂 DNA(請參見圖 12-4)
a. 準備如下 DNA 溶液，并置于噴霧杯中。
DNA 樣品（來源于步驟 3 ) 5~10ug
10XTM 緩沖液（pH8.0) 200ul
無菌 100% 甘油 1 ml
無菌水 至終體積為 2 ml
b. 將 DNA 樣品置于冰浴中，依據經驗用最適條件噴霧處理 DNA 樣品。
DNA
片段的大小主要決定于氮氣的壓力。例如，8psi(0.56 kg/cm2) 壓力處理黏粒栽體 DNA 主要產生 1000~2500bp
大小的片段。對一個新的靶 DNA 的最適噴霧壓力和噴霧時間要依據經驗確定。同超聲處理-樣，冰水浴可以防止 DNA 降解，同時對產生大小均勻的
DNA 片段有重要作用。
C. 將噴霧器置于合適的離心機轉頭中，用聚苯乙烯泡沫塑料做襯蟄。于 4°C 2000 g(配備微孔板放置裝置的離心機用 1000r/min) 快速離心使樣品 DNA 溶液沉積于噴霧杯的底部。
d. 將 DNA 樣品溶液分成四份，轉入 1.5 ml 離心管中，按標準方法乙醇沉淀 DNA, 真空干燥 DNA 沉淀。
e. 用 35ul TE(pH7.6) 溶解每一份 DNA 沉淀，取 1ul 噴霧處理的 DNA 樣品和適當分子質量大小的 DNA 分子質量標準，用 0.7% 瓊脂糖凝膠電泳分析 DNA 片段大小。電泳時余下的 DNA 樣品 4°C 保存。
如果得到的 DMA 片段大小不合適，改變噴霧條件，再次進行噴霧處理。如果得到的 DNA 片段大小合適，繼續按步驟 5 所述進行 DNA 末端修補。
DNA 的修補、磷酸化和大小選擇
噴霧處理和超聲處理產生的
DMA 末端是高度不均一的，包括平末端和殘損末端、帶有磷酸基團和不帶磷酸基團的末端。因為在這些分子中只有一部分能被 DNA
聚合酶修補，流體靜力剪切的 DNA 克隆到 M13 噬菌體上的效率通常較低。不過超聲處理 5~10ug 靶 DNA,
經過修補和選擇大小適當的片段，一般能形成幾千個重組克隆。
5. 在打斷的 DNA(約 25ul) 中，加入：
10XT4 噬菌體 DNA 聚合酶緩沖液 4.0ul
2.0 mmol/L 含四種 dNTP 溶液 4.0ul
T4 噬菌體 FJNA 聚合酶 5 單位
水 至終體積 40ul
于室溫溫育 15 min，然后加入約 5 單位 Klenow 片段，繼續于室溫溫育 15 min。
該反應使用兩種
DNA 聚合酶修補由于流體靜力剪切產生的 DNA 片段的殘損末端。T4 噬菌體 DNA 聚合酶補平
3'凹端，并且其外切酶活性可去除突出端。Klenow 片段提供了第二種補平 3'凹端的工具. 有關內容可參見信息欄"大腸桿菌 DNA 聚合酶 Ⅰ
Klenow 片段"部分。
6. 用酚: 氯仿抽提純化 DNA。上層水相轉移到一個干凈試管中，使 NaCl 濃度達到 0.1mol/L, 加 2 倍體積乙醇，回收沉淀 DNA。用 70% 乙醇洗 DNA 沉淀。
7. 加入 25ul TE(pH7.6) 重新溶解沉淀 DNA。
8. 在微量離心管中混合如下組分：
打斷的 DNA 23ul
10x 多核苷酸激酶緩沖液 3ul
20 mmol/L.ATP 3ul
T4 噬菌體多核苷酸激酶 1 單位
T4 噬菌體多核苷酸激酶催化平末端 DNA5'端磷酸化，此步驟不是必需的. 但是一般情況下可以提高 DNA 片段與載體的連接效率。
9. 于 37°C 溫育 30 min。
10. 用 0.8% 低熔點瓊脂糖凝膠電泳或 5% 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳（參見第 5 章）純化所需大小（0.8~1.5kb)DNA 片段。
為最大限度地減少污染的可能性，應在斷裂靶 DNA 和標準參照物之間空出幾個泳道，這一點在使用平端 DNA 作為參照物時尤為重要，因其與載體 DNA 的連接效率明顯高于剪切的靶 DNA。
11. 用第 5 章描述的方法從凝膠上回收靶 DNA。用 25ulTE(pH7.6) 溶解純化的 DNA。
12. 取 1ul DNA 用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析所純化 DNA 的完整性和回收率。
與載體 DNA 連接
13. 設立一系列試驗連接反應，其中含有 50ng(~0.01pmol) 線性化和去磷酸化載體
DNA 及濃度遞增的平端、磷酸化的靶 DNA 片段（見表 12-2)。
14. 連接液通過電轉移或轉化適當菌株的大腸桿菌感受態細胞（參見第1章的方法23~26)。將細菌鋪于含IPTG和X-gal的培養基上，37°C培養過夜。
這一步驟的目的在于找出一個靶DNA片段的濃度，以便最大限度地減小含有人為融合的靶片段的重組體，而后者會使測序更為復雜。因此，當確定大量的連接反應時（步驟16),
必規注意避免使用飽和量的靶DNA。相反，所定出的靶DNA量應為重組克隆的數目與背最相比有中等程度的提高（大約提高至5倍)。
15. 次日計數藍噬菌斑和白噬菌斑的數目。
采用斷裂的平端靶DNA所得的重組體數目大約僅為采用限制性內切核酸酶制備的平端DNA所得數目的十分之一{例如同用Alu I消化的λDNA或ΦX174DNA作為起始連接反應相比)。
16. 用最小量的斷裂的平端靶DNA設立一個較大規模的連接反應，以便獲得足夠的重組克隆完成測序任務。用連接的 DNA轉化大腸桿菌，37°C培養過夜。
這一步驟的目的在于確保毎個靶片段至少獲得五個重組充隆。圖12-5表明了覆蓋95% 的雙鏈靶DNA序列所必須測定的克隆的大概數目。
17, 次日收集平板，將轉化子保存在適當條件下備用。從一系列單個無色噬菌斑中制備DNA 模板的方法見第 3 章的方法4。
M13重組噬菌體噬菌斑應盡快挑出和擴增（參見第
3 章的方案 2的「噬菌斑的挑取」專欄)。因為噬菌體顆粒可以在頂層瓊脂中擴散至較遠距離，在37°C生長長時間（>12~16
小時）的噬菌斑或者在 4°C 存放數天的噬菌斑往往已被污染。因此使用從時間較久的噬菌斑制備 DNA
進行測序反應時，背景帶的強度和數目都有所增加。
用 96 管盒培養 M13 噬菌體重組克隆
按第3章的方案2
所述方法挑取單一無色噬菌斑，接種在含有 2 ml 細菌培養基的 15 ml 試管中進行培養。然后分別回收備重組病毒顆粒，純化
DNA(參見第3章的方案 3 和 4)。由于每次只能處理 12 或 24 個克隆，模板純化過程費時且繁瑣。大規模的 DNA 測序需要成千上萬的
DNA 模板，但采用有機溶劑抽提和多步離心方法不能快速、經濟地制備單鏈 DNA 模板。取而代之的 M13
噬菌體模板大量制備方法通常包括噬菌體顆粒的純化或結合自動化技術設備（e.g.,please see Mardis and
Roe1989;Smith et al.1990) 用過濾法（Eperon1996)、磁珠法（Alderton et
al.1992;Wahlberg et al.1992;Hawkins et al.1994)
或順磁球法（Fryetal.1992;Wilson1993) 純化單鏈
DNA。但是這些設備和操作設備所需的工作人員是一般的學術機構所不具備的。不過 Zollo 和 Chen(1994) 報告了一種用于在 96
孔板中培養 M13 噬菌體克隆，并制備單鏈 DNA 的有效的可重復的方法，滿足了基于熒光的自動化 DNA 測序儀對大量模板的需求。
在鳥槍法測序中，使用一次性平底孔板或一次性試管組盒，以少
M 細菌培養物培養 M13 噬菌體重組子，同時處理 96 個樣品是非常有效的。所有單鏈 DNA
模板制備有關的后續步驟都可以在同一塊板中進行，減少了一步又一步轉移克隆的工作量，使一個研究人員可在一天內制備 960
個或更多的DNA模板（Pleasesee Zollo and Chen1994)。
18. 對 96
個克隆，每一個克隆都逐一地將大腸桿菌 F'菌株（如 XLl-Blue、XLl-Blue MRF'或 HD5αF') 的單一菌落接種到 100
mlLB 或 2 x YT 培養基，并加至容量為 500 ml 的培養瓶中。于 37°C 以 300r/min 振蕩培養 6~8 h。
19. 在培養液中加入 MgS04 至終濃度為 5 mmol/L。
為了保持離心時的平衡和對稱，培養的 M13 噬菌體的克隆數為 96 的偶數倍。
Mg2+能提高 M13 噬菌體產量，并降低不同克隆間生長速度差異。
毎組 96 個 M13 噬菌體克隆約需要 80 ml 培養細胞。
20. 用多道移液器轉移 0.8 ml 細胞培養液至 96 管盒的各管中。
21. 帶上手套，用無菌牙簽在每一個 96 管盒的各管中接種單一無色的 M13 噬菌斑。用牙簽穿刺噬菌斑的中央，然后投入培養管中。
22. 為避免造成混亂，將牙簽保留在培養管中直到所有 96 個培養管都接種完畢。
23. 當最后一個噬菌斑挑取完成，取出所有牙簽，封閉培養管盒。培養管盒做好標記，放入 37°C 搖床中，以 250~300r/min 振蕩培養 8~12 h。如果需要可重復步驟 20 和 21。
如果培養時間超過
12 h, 制備的單鏈模板將會被大量的 M13 噬菌體雙鏈復制型 DNA 和/或染色體 DNA 所污染。來源于細菌裂解產生的 DNA
將加大雙脫氧測序反應中錯配引物的機會。長時間培養也將加大 DNA 克隆片段缺失和重排的機會。因此，適當短時間培養是本方法成功的關鍵。
M13DNA 的純化
24. 從培養箱中取出培養管盒，2400 g(帶有微量板套筒的離心機轉速為 3000~3250r/min) 離心 20 min 沉淀菌體。
M13
噬菌體克隆的主要保存方法是在 50ul 懸液中加人 25ul80%
的甘油，用衡量加樣器上下吹打混合溶液，貯存板保存于-80°C。如果需要再制備模板
DNA，這些板作為感染用的噬菌體來源。本方案最后要強調的是安全地保存噬菌體，在本方案中各管間有較大的交叉污染的可能，這對 DNA
測序影響不大，但對于種源的保存是不能接受的。
25. 用多道移液器在新的 96 管盒的各管中加入 120ul 含 20%PEG8000 的 2.5 ml/L NaCl 溶液。
26. 從離心機小心取出離心管，用多道移液器從各管中分別吸取 0.6 ml 上清液加入到已加有 PEG/NaCl 溶液的各管中。
重要：在本步驟中一定不要攪動菌體沉淀，混有菌體將顯著降低 DNA 測序質量。
27. 用 96 管蓋蓋上裝有噬菌體懸液和 FEG/NaCl 溶液的試管，確保形成牢固的液封，顛倒試管幾次，以混合內容物。試管盒室溫放置 30 min, 然后冰浴 30~60 min。
28.2400 g(帶有微量板套筒的離心機轉速為 3000~3250r/min) 離心 30 min, 收集沉淀噬菌體。取出各排試管，倒置于水槽上空干，在每支試管底部可見少量白色沉淀。將試管放回試管盒。
29. 當所有試管被空干，將試管盒倒置在吸水紙上幾分鐘空干殘存的痕量液體。重新換上新吸水紙，將倒置的試管盒與吸水紙放入離心機中，以 300r/min 離心 3~5 min 去除最后殘存的痕量 PEG/NaCl 溶液。
30. 從離心機中取出試管盒，檢查試管底部是否仍有噬菌體沉淀。每管加入 20ul TTE 緩沖液。
如果唯菌體生長良好，沉淀呈白色不透明狀；如果生長不好，沉淀呈帶點藍色不透明狀。如果沉淀呈褐色團塊，很可能是因為在步驟 26 取菌體量過多。棕色沉淀制備的模板測序所得結果欠佳。
31. 用 3M 銀色膠帶密封試管口，在多管旋渦振蕩器上劇烈振蕩試管盒 15~30 min。
32. 快速離心試管盒使液體沉于管底，去掉每一個 96 孔管盒底座，將試管置于 80°C 水浴中保溫 10 min。
該步驟是為了裂解 M13 噬菌體顆粒。去掉管盒的底座可以確保所有的試管在 80°C 保溫達到 10 min。
33. 從水浴中取出試管并冷卻至室溫。重新安上試管盒底座，快速離心試管盒使液體沉于管底。
34.
用多道移液器將 70ul 無菌水加到 96 孔板的各孔中，將步驟 33 獲得的噬菌體裂解液轉移到 96
孔板中，用移液器吹打混勻兩種溶液。用一條 3M 銀膠帶密封 96 孔板，如果在 24~48 h 內進行測序也可以用 96
孔板蓋板蓋住。標記好各塊板，貯存于-20°C。
每進行一次培養可以提取到 2.5~5ulM13 噬菌體單鏈 DNA。
35. 隨機從一些孔中取 DNA 樣品（5ul), 用 1% 瓊脂糖凝較電泳檢査 DNA 量。
如果一切正常，各管中的 DNA 產雖差別很小。DNA 循環測序反應一般需制備的 DNA 量為 2ul~7.5ul
(參見方案 6)。
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