微衛星DNA分子標記及其應用（二）

3. 微衛星分子標記技術的應用

微衛星DNA 作為遺傳標記具有很大的優越性。近年來隨著研究的不斷深入,對微衛星標記的研究不僅具有重要的理論意義, 而且還具有較好的應用前景。

3.1 微衛星多態性分析

在自然界中,生物個體表現出來的各種遺傳變異,在本質上就是DNA 的差異,因此通過研究DNA的變異來分析群體的遺傳結構及遺傳多樣性更為直接。微衛星其重復單位數量可能不完全相同,因而形成多態性,即SSR 分子標記,這可能是由于有絲分裂過程中同源微衛星間的不等交換或復制過程“鏈滑”(strand slippage) 作用造成的。微衛星多態性反映著物種的進化歷史,共有的等位基因在該物種基因組中最為古老、保守。與蛋白質標記技術相比較,利用微衛星標記估計的群體遺傳雜合度和遺傳距離明顯優于蛋白質多態性標記,而且在分析遺傳關系較近的種群和品種時,微衛星標記比蛋白質標記具有更為準確的數值。

3.2 群體遺傳多樣性

Powell 等指出微衛星比其他分子標記如RFLP、RAPD、AFLP 更能揭示遺傳多樣性。Scott 等根據從5000個葡萄表達序列標簽( ESTS) 中分離的124 個微衛星而設計的16 對SSR 引物,對7 個葡萄資源進行分析。結果證明: 在3’非翻譯區(3’U TR) 分離的微衛星在品種間具有較高的多態性;在5’非翻譯區(5’U TR) 分離的微衛星在種和品種間具有較高的多態性；而在編碼區分離的微衛星在種和屬間具有較高多態性。Fahima 等的實驗證實,單子葉植物大麥及雙子葉植物鷹嘴豆也存在串聯排列( GTAT) n和簡單重復序列( GACA) n ,而且顯示出高度多態性。Plaschke 等用23 個SSR 標記對40 份歐洲小麥品種進行檢測,共發現142 個SSR多態性位點,平均每個SSR 標記能檢測到6.2 個多態性位點。郭小平等用137 對有擴增產物的引物對2 個玉米自交系B14 和B96 進行分析,發現有67 對引物顯示多態性,反映了這2 個自交系在遺傳物質上的差異。楊官品等用一個多拷貝微衛星DNA 標記分析了238 份栽培水稻的遺傳多樣性及遺傳多樣性從農家品種到現栽培品種的動態變化,共檢測出16 種長度變異類型和32種表現型,表現了較高的多態性。Turuspekov Y等用微衛星引物分析了代表日本主要栽培地區的18 種大麥品種的遺傳多樣性,Shannon信息含量最高的是Kanto 地區,為0.524；而含量最低的是Tohoku 地區,為0.264。遺傳距離從Tohoku 和Tozan 地區的0.105 到Shikoku 和Kyushu 地區的0.88 。通過聚類分析表明,同一地區栽培的品種大都歸為一類,這反應了大麥在日本在栽培不但受歷史親緣關系的影響,同時也有地理和環境因素的影響。Tanya P 等用SSR 對5 個韓國大豆品種、8 個泰國大豆品種和3 個野生大豆進行了遺傳多樣性分析。

3.3 基因定位及構建遺傳連鎖圖譜

由于微衛星重復單位數量多，重復單位片段短，且重復程度不一樣，同一類微衛星可分布在整個基因組的不同位置上，可將隨機PCR標記沿著染色體錨定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微衛星標記來源于基因本身的序列，因而通過對微衛星標記的定位，也就相應地定位了其來源基因。Beckmman和Soller 認為, 多態的簽條微衛星( Sequence - tagged Microsatellite site ,STMS) 對基因定位提供了有效的標記。

遺傳連鎖圖譜是利用遺傳標記進行連鎖分析來反應遺傳標記之間的相對關系。現在使用最廣泛的是微衛星標記。其基本原理是：以微衛星位點為基礎，在基因組中每隔一定距離找一個多態性的微衛星標記，當這些標記達到足夠的飽和度（約每隔10-20cm一個，并覆蓋90%的基因組）后，則可借助微衛星標記找到基因組中的任何功能基因和QTL，并進行連鎖分析，從而確定QTL在圖譜的位置、與標記之間的遺傳距離和QTL的表型效應。Akkaga等將121個微衛星標記整合到水稻四個群體的RFLP框架圖上，平均每16-20cm就有一個微衛星標記。擬南芥、水稻、番茄、土豆和玉米在遺傳圖譜上1cm分別相當于物理距離的150kb、300kb、500kb、1000kb和1500kb。相信隨著分子遺傳標記技術尤其是微衛星技術的進一步完善,對于構建基因文庫將會起到進一步的推動作用。

3.4 構建指紋圖譜

基因組中各微衛星位點除重復數不同外，其堿基組成和結構是相似的，因此可以以微衛星的核心序列如（AC）n、（TG）n等作為多位點探針，在基因組中同時檢測多個位點。由于不同個體、品種（系）或群體在被檢測位點上存在一定的差異，通過電泳及雜交，這些差異將表現為雜交帶的有無，即產生微衛星DNA指紋圖。B.Beyerman等通過DNA指紋印跡技術，利用簡單重復序列（GATA）₁和（GTG）₅作探針，證實了大麥和甜菜DNA指紋印跡區帶的顯著差異。

3.5 用于種質鑒定和品種分類

由于微衛星座位的復等位性，使它易于鑒別同一物種的不同基因型。Guilford等利用（GA）₁₅（GT）₁₅作為探針篩選蘋果基因組文庫，證明了這些重復序列的多態性，并且利用3個微衛星標記就能足以區分21個蘋果品種。Akagi等利用高度多變的含（AT）n的17個微衛星標記，成功地區分了59個親緣關系極近的粳稻品種。Aranzana MJ用SSR對100個桃品種進行分析，用7個多態性微衛星位點得到32個等位基因，可區分78個不同的基因型。

3.6 分子標記輔助選擇

微衛星標記應用于標記輔助選擇具有很大的潛力，它改變了從表型值推斷基因型值的選擇過程。分子標記輔助選擇相對于傳統的表型選擇來說，可以獲得更大的遺傳進展，尤其對于低遺傳力性狀、限制性狀和后期表達的性狀，能增大選擇強度，縮短世代間隔，提高選擇的準確性。Zhang等利用微衛星標記來預測產量和估計雜種優勢。

4. 展望

微衛星DNA的研究近年來已取得了明顯進展,但微衛星DNA標記還存在很多問題，如微衛星DNA分子突變機制尚不完全清楚、PCR引物在不同物種間保守性較差、對于不同物種要進行特異性引物設計等，但微衛星DNA仍然是研究當前種內遺傳變異中分辨率最高、揭示力最強的核DNA標記。相信隨著微衛星DNA研究的不斷深入，微衛星必將會在各個領域中有著更為廣泛的應用。