微流控技術在心肌標志物檢測中的應用

　　自50年代以來，動態測定一些代謝酶活性，如乳酸脫氫酶和谷草轉氨酶等，一直是診斷AMI（Acute Myocardial Infarction，急性心肌梗死）的金標準。但由于這些代謝酶在人體的其他器官和肌肉中也大量存在，除 AMI外，運動、炎癥也可引起乳酸脫氫酶和谷草轉氨酶等的升高，所以對他們的檢測不具有提示患有AMI的特異性。近幾年來，一些新的具有高度特異性和敏感性的心肌標志物檢測指標被普遍用于臨床實驗室診斷，如心肌肌鈣蛋白T(cTnT)或心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌紅蛋白 (Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、B型尿鈉肽(BNP)和超敏C 反應蛋白(CRP)等。正確應用這些新的心肌標志物，為臨床準確診斷、鑒別診斷和判斷治療效果起到了革命性的作用。微流控芯片技術作為近年來發展迅速，集生物、化學、醫學、流體、電子、材料和機械等于一體的嶄新研究領域，具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度快和高通量測試等特點，可以在幾分鐘甚至更短的時間內進行上百個樣品的同時分析，并且可以在線實現樣品的預處理及分析全過程，是進行心肌標志物檢測的理想平臺。

　　微流控芯片光學方法檢測心肌標志物

　　目前對于心肌標志物的檢測，大多是基于抗原抗體的免疫反應。生物學家通常利用熒光物質 標記抗原或抗體或酶標抗體，然后從反應生成物的熒光強度、反應底物比色和捕獲化學發光底物微光來定量被檢測物的濃度。底物可見光比色法因靈敏度相對較低，一般無法滿足低濃度心肌標志物的檢測需求，應用較少。而熒光免疫方法因具高靈敏度而被多數研究者采納。

　　對于微流控芯片微米級的檢測通道，熒光免疫方法有時并不能滿足低濃度心肌標志物的檢測要求。為此，有團隊創造性地設計了濃縮熒光標記物的反應池和嵌入式光電倍增管檢測裝置，實現了對C反應蛋白（C-Reactive Protein，CRP）的低濃度檢測。其具體實驗過程如下：首先制作了帶1mm×0.8mm×30um預濃縮反應池的T型聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)芯片，在反應池中設計物理微結構富集CRP抗體包被的磁珠；然后將熒光標記的CRP抗原和待檢測CRP抗原注入反應池，孵育后洗脫熒光標記；最后在反應池下游微通道利用嵌入式光電倍增管檢測熒光信號，結果測得CRP最低檢測限為1.4 nmol/L。該方法有效地提高了檢測的靈敏度，但缺點在于磁珠修飾抗體和熒光標記抗原等操作都必須在芯片外進行，檢測時間相對較長。

　　微流控技術在心肌標志物檢測中的應用

　　利用微流控芯片平臺分析生物標志物時，常需各種進樣泵和驅動泵等，使平臺極其復雜。有團隊利用空氣在PDMS中溶解度高和擴散速度快的特性，研制了無動力注射的免疫分析芯片。該芯片具有結構簡單、使用方便等優點。在實驗過程中，他們對競爭法和夾心法非均相免疫分析都進行了研究，操作如下：通過先將抗體修飾于內壁，再利用熒光法檢測兔IgG和人CRP。最終結果顯示：樣品消耗為1μL，免疫分析時間為 20 min，檢測限分別為 0.21 nmol/L和0.42 nmol/L。以上表明該方法具有樣本消耗少、分析時間短和檢測靈敏度較高等優勢。

　　微球免疫分析通常能增大抗原抗體的結合面積，縮短抗原抗體所需要的反應時間，提高檢測 靈敏度。有團隊在硅片上加工出微室陣列，將共價鍵合抗體的瓊脂凝膠微珠裝入微室中，通過毛細管引入各種反應試劑，然后利用熒光或可見光比色檢測唾液中 CRP，最終 12 min 完成檢測，最低檢測限達5 fg/mL，而在10 fg/mL～10 pg/mL間有較好的線性相關性，檢測靈敏度優于商品化超敏CRP ELISA檢測試劑盒。這種微球分析與微流控結構相結合的系統，靈活減小了分析設備體積，實現了唾液中微量CRP的超靈敏檢測。

　　芯片表面的親疏水性直接影響芯片的檢測效果。表面改性一直是微流控芯片的重點研究領域。國外團隊對環烯共聚物(Cycloolefin Copolymer，COP)芯片表面性質進行改性：分別用氧等離子體氧化、3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)硅烷化和右旋糖酐修飾來增加其表面親水性，進而易于捕獲抗體結合。該改性手段穩定可靠，結合免疫檢測方法，實現了對血液中CRP的低濃度檢測，最低檢測限達 2.6 ng/mL。

　　利用微流控芯片平臺高通量分析心肌及其他生物標志物，可以節約檢測成本和時間，是未來的發展趨勢。國外研究機構結合非競爭免疫分析、裂解標記免疫分析(Cleavable Tag Immunoassay， CTI)和膠束電動色譜(Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC)，同時分析了AMI的CK-MB、cTnT、cTnI和Myo四種心肌標志物。通過對以上四種心肌標志物抗體進行不同熒光物質標記，使反應后被切割的熒光標簽在芯 片MEKC中層析分離，而每種熒光標記在芯片MEKC 中有不同的遷移率，通過定量不同熒光 標簽量來定量各組分標志物濃度。利用該平臺對CK-MB、cTnT、cTnI和Myo的檢測限分別為 3 ng/mL、25 pg/mL、2 ng/mL和5 ng/mL。該研究的局限在于CTI 和 MECK分開進行，未能整合在一塊芯片上實現。故該研究組還在研究芯片在線CTI，將芯片在線CTI與芯片MEKC結合，真正實現微流控芯片的高通量分析，促進即時診斷產業的發展。

　　微流控芯片電化學方法檢測心肌

　　與光學檢測方法相比，電化學方法具有靈敏度高、反應快、電極微型化、對芯片材質沒有特殊要求等特點。電化學方法已慢慢成為當今微流控平臺的主要檢測手段。

　　隨著微電極加工技術的發展，研究者經常采用一些特殊技術結合電化學檢測方法來達到痕量 檢測。如利用自組裝單層膜技術結合電化學檢測方法，檢測Myo和血紅蛋白。該研究中工作電極是1 cm×2 cm的金修飾硅片，其表面修飾有自組裝單層膜，當待測樣本結合到膜上時，工作電極與參比電極間電位發生改變，通過檢測電勢變化而測定樣本中蛋白濃度。將此技術與微流控芯片相結合，減少待測樣本體積和檢測時間，增加反應靈敏度，是理想的即時診斷平臺。

　　微流控技術在心肌標志物檢測中的應用

　　利用量子點標記抗體結合方波溶出伏安法(Square-Wave Anodic Stripping Voltammetry)同時檢測兩種心肌標志物cTnI和CRP。通過SWASV與微流控平臺結合，利用微通道電泳濃縮并輸送金屬離子。當cTnI和CRP分別在0.01～50μg/L和0.5～200μg/L范圍內時，檢測電流與檢測物濃度具有較好的線性一致性。該方法檢測cTnI和CRP的最低檢測限分別為0.004μg/L 和0.22μg/L。通過極譜電流時間曲線法監測電子轉移，實現了對 cTnT 的超靈敏檢測。作者加工了具有多個電極的COP微流控芯片，該芯片含一個捕獲磁珠帶、兩個參比電極和一個工作電極，可同時獨立檢測六個樣本。作者用該系統檢測了溶解在PBS中的cTnT和真實血樣中的cTnT 含量，最低檢測限分別達0.017 ng/mL 和0.02 ng/mL，靈敏度大大超過傳統手段。

　　另外，離心微流控磁盤因其自動化、可一次性使用、不用注射泵、沒有復雜的流體相互聯系、僅靠離心力驅動樣本等特點，在微流控芯片領域廣受歡迎。

　　其他微流控芯片檢測心肌標志物

　　隨著傳感器技術的迅速發展，越來越多的檢測手段被用在對心肌標志物的檢測。如設計與玻片鍵合的T型PDMS芯片，同時在玻片上加工兩塊鍍金薄膜A和B。樣本中的BNP通過 EDC/NHS系統先與薄膜A結合，之后加入乙酰膽堿酯酶修飾的抗BNP抗體，然后再加入硫代乙酰膽堿，硫代乙酰膽堿在乙酰膽酯酶的催化下變成硫代膽堿并流動至薄膜B上聚集。而薄膜B處有表面等離子體共振(SPR)檢測裝置，硫代膽堿在薄膜B處的聚集可引起SPR角度改變。之后根據硫代膽堿的濃度與上游加入薄膜A上的BNP 濃度成反比，進而可通過SPR 角度改變來測定BNP濃度。結果表明該系統檢測BNP時，在5 pg/mL～100 ng/ml具有較好的靈敏度，檢測時間僅為 30 min。

　　有團隊采用光子晶體內全反射系統(PC -TIR)，設計一個獨特的敞開光學微腔，以便功能化微腔表面，使抗原抗體更好地結合。作者用四氫呋喃、APTES、羧甲基右旋糖酐等處理傳感器 表面并固定Myo 抗體在其上，利用PDMS加工的微通道輸送待測樣本和對照液體PBS到傳感器部位。當待測樣本中目標抗原Myo與傳感器表面抗體結合后，共振波長反射泡發生漂移，波長的偏移值與待檢測的Myo濃度成正比。該法檢測限達70 ng/mL，在70～1000 ng/mL 范圍內有較好的線性一致性。

　　光學法檢測心肌標志物主要包括熒光和化學發光兩種方法。熒光法需要外加光源激發分子產 生能級躍遷，進而發光。由于生物樣品中的蛋白質、氨基酸等分子也會產生背景熒光，故需選擇合適的熒光試劑和樣品處理方法，減少非特異性吸附蛋白的影響，降低背景干擾。而化學發光是自身發光，無需外加光源，背景干擾小，靈敏度更高，但需暗室及進行冷發光檢測，其檢測器體積相對較大。電化學分析法可分為電導分析法、電位分析法、伏安法、極譜分析法、電解和庫侖分析法等。這些方法分析靈敏度和準確度較高、測量范圍寬、儀器設備簡單、價格低廉，運用于微流控芯片檢測平臺時，對芯片材質沒有特殊要求，并可以將電極微型化以減小平臺體積。與光學法相比，電化學法在心肌標志物檢測方面具有更廣闊的應用前景。

　　微流控芯片作為一門新興學科，可以集進樣、預處理、分離和檢測于一體，具有樣品需求量小、便攜、分析快速等特點，是理想的心肌標志物檢測平臺。研究和發展適應于心肌標志物即時診斷的微流控芯片產品，符合檢驗醫學自動化和簡單化的發展趨勢，適應當今社會高效、快節奏的工作方式，滿足心血管疾病患者在時間上快速檢測的要求，可使患者盡早得到診斷治療。