慢病毒載體包裝之后成為假病毒顆粒后，可用于：（1）感染原代培養細胞；（2）制備穩定表達/沉默特定基因的單克隆細胞株；（3）in vivo的基因操作、轉基因動物，特別是轉基因大鼠的制備。
| 實驗方法原理 | 慢病毒是反轉錄病毒的一種，具有反轉錄病毒的基本結構和特性：整合入宿主細胞基因組，長期表達，可用于轉基因動物制備；但也有不同于反轉錄病毒的組份和特性：比反轉錄病毒具有更高的滴度，不僅可以感染分裂期細胞，更重要的，還能感染非分裂期的細胞。利用慢病毒載體，可以研究啟動子的調控、過表達特定基因或沉默特定基因。 |
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| 實驗材料 | 質粒293T細胞 |
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| 試劑、試劑盒 | 無血清培養基脂質體胰酶含血清的培養基DMEM |
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| 儀器、耗材 | EP管6孔板CO2培養箱高速離心機-80°C冰箱 |
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| 實驗步驟 | 以六孔板中的1孔為例，每個樣品需要1x106個293T細胞。 1. 取1.5ml滅菌EP管，加入1.5ug包裝混合質粒和0.5ug表達質粒以及250ul的無血清培養基。輕柔混勻，室溫孵育5min。 2. 取1.5ml滅菌EP管，取9ul 脂質體2000l溶于250ul無血清培養基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。 3. 將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min 4. 用胰酶消化并記數293T細胞。用含血清的培養基重懸細胞。 5. 在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養基，再加入DNA-脂質體復合物。 6. 將1ml重懸的293T細胞（1x106個細胞/ml）加入到平板中。37℃ CO2孵箱中孵育過夜。 7. 移除含有DNA-脂質體復合物的培養基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。 8. 轉染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。 9. 病毒上清-80℃貯存。 包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。 展開 |
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| 注意事項 | 1．慢病毒理論上可以包裝5～7Kbp的片段，但過大的片段包裝會影響病毒的出毒效率，導致獲得的病毒滴度較低，影響病毒感染效果。因此一般建議最好將包裝的片段控制在1.5Kbp以內。 2．病毒載體易突變和丟失，克隆過程中可能出現質 粒的包裝信號突變或大小不等的片段丟失，導致無法成功包裝出病毒。因此建議構建好含有目的基因的克隆載體(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先進行測序，以確保關鍵序列都正確無誤。 3．包裝細胞多選擇為293T或293FT。要求細胞生長旺盛、狀態良好，避免過密生長和體外傳代次數過多。 4．轉染時對質粒純度要求較高，最好為去掉內毒素 的超螺旋質粒，以提高轉染效率。多采用磷酸鈣轉染方法，既節約成本又可獲得高的轉染效率(一般可達到80％～95％)。 5．無論是三質粒或四質粒慢病毒系統，轉染的各質 粒之間的比例非常重要，直接影響出毒效率。不同公司提供的質粒有所差別，因此無法一概而論，需要根據給出的比例進行調整優化。
6．轉染前，細胞密度控制在50％～60％為佳。轉染前4～8h換液，轉染后不換液。轉染第2天添加丁酸鈉(TPA)可明顯提高出毒率，之后8h再換液。每次換液前應將培養基預熱至37℃，換液時動作輕柔以防細胞漂起。
7. 一般情況下，轉染48h后收獲得到的病毒顆粒最多，但也與當時細胞狀態、生長速度和培養基pH值有關。收獲病毒時培養基應呈紅色，若過酸呈現黃色則會降低病毒收獲率。 8. 不同廠家和批次的血清對病毒的產量影響很大， 需要篩選。 9．病毒液避免反復凍融，否則明顯降低效率。 10．一般情況下，病毒液于-80℃中可保存1年，但建議半年之后重新檢測病毒滴度。 展開 |
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| 其他 | 構建慢病毒載體的過程比較復雜，自己構建既費時又費錢，一般情況下委托生物公司代為構建比較好。目前國內已有公司提供慢病毒的包裝，研究人員只需將欲包裝的基因序列號或堿基序列提供給公司，即可在2～3個月內拿到純化好的3×107—30×107Tu的病毒顆粒，可直接用于細胞水平或動物體內實驗，所有費用約為1.8萬。
來源《腫瘤分子生物學與細胞生物學實驗手冊》，《細胞與分子生物學常用實驗技術》。 展開 |
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