抗磷酸肽的多克隆抗體制備實驗

用磷酸肽-BSA 交聯物免疫過的兔的粗制血清

PBS／疊氮化物MgCl2

分光光度計透析袋填裝有 BSA-瓊脂糖親和介質的柱子填裝有磷酸酪氨酸親和介質的柱子填裝有同種非磷酸肽親和介質的柱子填裝有同源的磷酸肽親和介質的柱子填裝有陽性-篩選的磷酸肽親和介質的柱子

1. 將填裝有 BSA-瓊脂糖親和介質的柱子和填裝有磷酸酪氨酸親和介質的柱子以串聯的方式連接好。

2. 使大約 15 ml 的粗制血清通過重力作用流過兩根柱子。用 PBS／疊氮化物溶液洗滌直到所有的黃色血清穿過柱子（或用分光光度計檢測流出液體的 A₂₈₀ 直至達到基底吸收值），再用 5~10 ml PBS／疊氮化物溶液洗滌，收集所有穿過柱子的洗滌液，其中可能含有所要的抗體。

待血清過柱后，可用以下步驟使柱子重生：依次用 10 倍柱床體積的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱床體積的 PBS／疊氮化物溶液洗滌柱子，然后在 PBS / 疊氮化物溶液中儲存于 4℃ 待用。

3. 使過柱后的血清通過重力作用反復多次流過填裝有非磷酸肽親和介質的柱子以盡可能地去除交叉反應，在每兩次過柱之間依次用 10 倍柱床體積的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱床體積的 PBS/疊氮化物溶液洗滌柱子以使柱子重生。

4. 如果預期與同源磷酸蛋白質有交叉反應，用步驟 3 中的方法使上步過柱后的血清流過填裝有同源磷酸肽親和介質的柱子。

5. 在收集陽性-篩選親和純化的餾分之前，預先浸潤并洗滌長約 25 cm 的透析袋。用透析夾夾住一端并檢查是否漏液。同時預先準備 6 L PBS／疊氮化物透析液并冷卻到 4℃。

6. 將上一步層析后過柱的血清流過陽性-篩選磷酸肽親和柱 3 次，每次過柱后不要洗滌柱子。

7. 收集最后一次流過柱子的血清，然后用 5～20 ml PBS／疊氮化物溶液（用量取決于預柱體積和柱床體積洗滌柱子，將洗滌液與過柱的血清合并。再用 20 ml PBS／疊氮化物溶液洗滌柱子，洗滌液分開收集以作為「洗滌」餾分。

8. 選用下列離液劑進行洗脫：20 ml 3 mol/L NaSCN, 或依次用 10 ml 3.5 mol/L MgCl₂ 和 10 ml 4.5 mol/L MgCl₂。開始洗脫后，立即收集約 3 ml 洗脫餾分直接到步驟 5 中準備的透析袋中，用透析袋夾夾住透析袋的近端并立即放入 PBS／疊氮化物透析液。至少收集 6 次洗脫餾分。

9. 將步驟 8 中收集的洗脫鍛分于 4℃ 對 PBS／疊氮化物溶液進行透析。

10. 通過測量 280 nm 處的吸光值或蛋白質比色測量法測量并計算出透析餾分中蛋白質的產量。從 15 ml血清樣品中通常可得到 > 1 mg 純化抗體。

11. 將抗體分裝成小份并儲存于 - 70℃；作為工作液的部分儲存于 4℃。

12. 用 ELISA 和免疫印跡檢測最終樣品以及前面各步收集到的餾分的反應性和交叉反應性。