1、配制所需試劑
SSC 溶液(20×):3mol/L NaCl,0.3mol/L 檸檬酸鈉。
Denhardt’s溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g,加水至500mL。
預雜交液:6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100μg/mL 經變性或斷裂成片段的鮭精 DNA。
2、操作步驟
(1)將含靶核酸的 NC 膜漂浮于6×SSC 液面,使其由下至上完全濕潤,并繼續浸泡2min。
(2)將濕潤的 NC 膜裝入塑料袋中,按0.2mL/cm2 的量加入預雜交液,盡可能擠出氣泡,將袋封口,置68℃水浴1～2h 或過夜。
(3)將雙鏈探針做變性處理使成單鏈,即于100℃加熱5min,然后立即置冰浴使驟冷。
(4)從水浴中取出雜交袋,剪去一角,將單鏈探針加入,盡可能將袋內空氣擠出去,重新封口,并將雜交袋裝入另一個干凈的袋內,封閉,以防放射性污染。
(5)將雜交袋浸入68℃水浴,溫育8～16h。
(6)取出雜交袋,剪開,取出濾膜迅速浸泡于大量2×SSC 和0.5%SDS 中,室溫振蕩5min,勿使濾膜干燥。
(7)將 NC 膜移入盛有大量2×SSC 和0.1%SDS 溶液的容器中,室溫漂洗15min。
(8)將 NC 膜移入一盛有大量0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,37℃漂洗30min 至1h。
(9)將 NC 膜移入一盛有新配0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,68℃漂洗30min 至1h。
(10)取出濾膜,用0.1×SSC 室溫稍稍漂洗,然后置濾紙上吸去大部分液體,待做雜交信號的檢測。