數字PCR應用（二）

發布時間：2020-04-21 18:03 原文鏈接：數字PCR應用（二）

4、能夠有效區分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準確度、精密度和重復性，可以用于精確測定靶基因的相對表達，基因拷貝數變異分析等。

圖4. qPCR和dPCR的對比

四．dPCR的多指標檢測的實現

如同qPCR一樣，dPCR中實現多指標的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。

不同于qPCR中的多腔室擴增與多熒光通道結合的并行PCR方式，在dPCR里，一個微反應腔室里一般只含一種靶基因。

圖5. dPCR的多指標并行檢測的實現方式

所以dPCR的多指標檢測主要通過以下兩種方式實現：

1. 多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因。

2. 單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結束時不同的靶基因對應的染料的熒光強度不一樣。

五．dPCR的分類以及相關的產品

微流控芯片技術能夠快速并準確地將樣品流體分成若干個獨立的單元, 從而進行多步平行反應，并且具有成本低、體積小和高通量等特點，是理想的數字PCR平臺。按照其獨立的單元的實現方式來細分，dPCR又分為基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式PCR。

5.1微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）

微滴數字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續中，從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優勢。

在ddPCR中，利用微滴發生器可以一次生成數萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數字 PCR 的樣品分散載體。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液，然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。

目前Bio-Rad公司的QX100系統、QX200系統均為采用液滴技術的數字PCR系統。

圖6. Bio-Rad的droplet digital PCR系統

5.2 微陣列芯片式PCR

微陣列芯片式PCR主要通過芯片設計將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進行后續的PCR擴增及擴增后結果的熒光顯微鏡直接判讀。

按芯片設計方式，微陣列芯片式PCR又可以分為陣列微池式芯片、滑片式芯片和集成微泵閥芯片：

1. 陣列微池式芯片上刻蝕有微池陣列，反應液由進樣孔直接導入個反應微池；

2. 滑片式芯片是設計帶有微流體通道和反應單元的玻璃芯片，上下兩篇玻璃芯片間用油相密封，通過滑動芯片將樣品溶液從液體通道引入反應單元，同時生成成百上千個微反應滴陣列；

3. 集成微泵閥式芯片是通過多層軟刻蝕技術在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交織的液體和氣體通道結構，通過精確地控制微泵閥的開啟和關閉，快速并準確地將流體分成若干個陣列的獨立單元。

2010年，Life Technologies也推出了基于陣列微池式芯片的數字PCR產品線–OpenArray系統。它提供的TaqMan OpenArray 數字PCR試劑盒可在OpenArray平板上運行。平板可在現有的OpenArray 實時定量PCR系統以及新上市的QuantStudio? 12K Flex儀器上運行。OpenArray 實時定量PCR系統能夠同時運行3塊OpenArray平板。