隨著分析方法的飛速發展，無論是食品中有毒有害物質，還是環境中痕量元素的檢測，或者生物體內功能因子的分析，都迫切需要一種靈敏度高、快速準確、性能穩定的痕量分析方法。時間分辨熒光免疫分析技術（time-resolved fluoroimmunoassay，簡稱為TRFIA）是20世紀80 年代中期發展起來的一種新的熒光標記技術。這種方法應用某些特殊的稀土金屬，能夠區分背景光的散射所引起的干擾，從而大大地提高了分析的靈敏度。與傳統的酶免疫法（EIA）、發射免疫分析法（RIA）相比，它具有很多優點:靈敏度高達10-19；穩定性好，克服了酶和放射性熒光物質的不穩定性；動態范圍寬；試劑貨架期長；無放射性危害等,時間分辨熒光分析目前被公認為是靈敏度最高的分析方法之一[1,2]。
一、時間分辨熒光免疫分析法的原理及優勢
時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）是在熒光分析（FIA）的基礎上發展起來的一種特殊的熒光分析法[3]。它利用了具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合物為示蹤物，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞，以代替傳統的熒光物質、酶、同位素、化學發光物質。用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應產物中的熒光強度，根據產物熒光強度和相對熒光強度的比值，準確地測定反應體系中被分析物的濃度。TRFIA 所使用的熒光標記物是鑭系稀土金屬[4]，由于鑭系稀土金屬離子螯合物有很長的熒光壽命(微秒級)，有別于傳統熒光的短熒光壽命，使其能通過時間分辨方式區別于背景熒光（鈉秒級），正是由于熒光衰變時間長，可以延緩測量時間，待測樣品中短壽命的本底熒光衰變后再測稀土離子的特異熒光，因此可完全消除本底熒光的干擾。鑭系稀土金屬離子螯合物熒光很寬的Stokes 位移使其容易通過波長分辨方式進一步區別于背景熒光，提高方法學的穩定性。鑭系稀土金屬離子螯合物狹窄的熒光發射峰使其熒光檢測具有很高的效率，進一步提高了信號檢測的特異性和靈敏性。此外，由于檢測時加入了熒光增強液，它可使原來熒光增強100萬倍，以上各種因素使TRFIA 的檢測靈敏度和準確性大大提高。
二、TRFIA 的反應模式
目前在實踐中應用的主要有固相雙位點夾心法和競爭法。夾心法多用于蛋白質類大分子化合物的測定，競爭法多用于小分子半抗原的檢測。反應模式流程如下：
1、雙抗體夾心法（檢測抗原）
一抗包被、封閉→加入檢測樣品→加入Eu3+標記的二抗→加入增強液→檢測。
2、競爭法（檢測抗體）
抗原包被、封閉→加入一抗/檢測樣品→加入Eu3+標記的二抗→加入增強液→檢測。
三 、傳統TRFIA 的改進
1、酶放大的時間分辨熒光免疫分析法
Papanastsiou-Diamandi等[5]報道這種分析技術，其原理與常規方法完全不同。本方法以堿性磷酸酶催化底物5- 氟水楊酸磷酸酯（FSA），FSA 與稀土離子Tb3+ 作用生成FSA－Tb3 + -EDTA 三元復合物。結合后的Tb3+在紫外光激發下可發出很強的熒光信號。不加增強液即可在時間分辨熒光儀上測量Tb3+ 的特征熒光。近年，我國趙啟仁等[6,7]也利用酶放大的時間分辨熒光分析法進行核酸雜交和堿性磷酸酶的測定，靈敏度達到10pg。
2、鏈霉親和素-生物素(SA-biotion)系統的時間分辨熒光免疫分析法
由于鏈霉親和素（SA）不帶糖基、等電點低，在檢測中具有比親和素(AV)低的背景而大大提高了檢測的靈敏性。SA-biotin系統可偶聯抗原、抗體、報告酶、寡核苷酸分子以及PE等熒光物質，因此，SA-biotin被廣泛用于生物反應檢測系統，用以檢測抗原、抗體及核酸分子[8]。 Andreas Rossler[9]利用鏈霉親和素-生物素系統的時間分辨熒光分析法檢測人體血液中玻尿酸的含量，靈敏度達到小于0.24mg/L也能檢測出來。血液中的玻尿酸的含量可以作為許多疾病診斷的標志，對于許多疾病的前期診斷具有很大的意義。
3、多標記技術的研究
TRFIA的多標記測量是目前標記技術中獨一無二的，其利用不同鑭系離子間的熒光波長和熒光衰變時間的差異，引入了兩種或兩種以上的鑭系離子標記物，通過時間分辨熒光測量，同時檢測樣品中的多種物質[10]。Eu3+在TRFIA中的使用率最高，常用于雙重標記的鑭系離子有兩對[11]：一對是 Sm3+和Eu3+，另一對是Eu3+ 和Tb3+。90年代，Xu等開發出的幾種共用熒光增強液（CFES）使得兩種以上的標記成為可能，而且不影響測量的靈敏度。多標記測定技術具有省時、省試劑和血樣的特點，可用于檢測多種分子的篩查實驗和一些珍貴樣品的檢測[12]。
4、固相TRFIA 技術的改進
為克服DELFIA體系缺點，Evagelista等[13]人建立的固相TRFIA技術，它以4,7- 二氯磺基苯-1,10 啡啉-2,9 二羧酸（BCPDA）為螯合劑，制備稀土標記免疫復合物。由于BCPDA分子結構具有增強熒光作用，無需加增強液，可直接檢測稀土標記免疫復合物的熒光。潘利華[14,15]等也通過BCPDA新型雙功能螯合劑標記BSA，對抗稀土污染的固相TRFIA系統的深入研究，將對稀土自然豐度高的我國，減少熒光背景干擾，提高熒光檢測靈敏度，具有潛在意義。
5、與其它技術的聯用
（1）與PCR 技術聯用
時間分辨熒光免疫分析技術與PCR技術相結合，可用于檢測特異的靶DNA 序列，簡稱PCR-TRF，使PCR產物的鑒定簡便易行。常用的方法[16]有：套疊式PCRTRF、雙標記PCR 法、PCR-TRFS直接定量法、時間分辨熒光掃PCR與TRFIA聯用來檢測病毒的核酸。Dahlen 報道，用Eu3+標記寡核苷酸引物進行PCR的擴增實驗，擴增產物中帶有Eu3+標記引物，可直接用熒光測定儀進行定量分析，不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色等步驟，使實驗操作過程大為簡化且提高了PCR的靈敏度和特異性。
（2）與激光技術聯用
激光- 時間分辨技術是脈沖激光和熒光檢測系統相結合而產生的。利用該技術進行放射性核素U和稀土元素Eu等已有報道，檢出限Mg/L～ng/L。于水等 [17～19]利用該技術已建立了Al 、Zn 、Mg 、Cd 的激光- 時間分辨熒光測定方法。7-碘-8-羥基喹啉-5-磺酸（Ferron）和8- 羥基喹啉-5- 磺酸（H2QS）是兩種廣絡性試劑，它們可以與等金屬離子形成熒光絡合物。根據這些絡合物當在不同介質中，不同增敏劑、掩蔽劑作用下產生不同的熒光特性，從而在多種物質共存時檢測某種離子，比如當1.0ml 0.01% H2QS，pH10 的NH4Cl-NH3OH 緩沖液時，Al3+幾乎不產生熒光，而Mg2+熒光強度最強，靈敏度比提高20倍。即使其他離子高出400倍共存時，也幾乎不影響測量結果。
（3）與流動注射分析技術聯用
Feng[20]和錢昌順[21]利用流動注射分析技術（FIA）進行純化分離待測物質，再利用TRFIA技術檢測。建立了癌胚抗原（CEA）檢測的新的分析方法。這樣既結合了FIA 的進樣操作簡單和在線分離檢測等優點，也利用了TRFIA 高靈敏度的特點，使常規的CEA 檢測時間從幾個小時縮減至幾分鐘，從而可以作為一種替代傳統ELISA 和反射免疫分析的方法。
（4）與電腦技術的聯用
隨著電腦技術的發展，國外TRFIA的測量儀器已經實現了高度自動化，操作軟件也逐步人性化，界面簡單，易懂。國內也有幾種儀器推出，實現了硬件的國產化，此外，光纖技術的引入，使得時間分辨熒光免疫分析成為一種名副其實的新型超微量分析技術[22]。
四、時間分辨熒光免疫分析法在臨床醫學上的應用
1、先天性甲狀腺功能低下癥的檢測
先天性甲狀腺功能低下癥,是由于先天因素使甲狀腺發育異常或代謝障礙,不能產生足夠的甲狀腺素引起生長發育減慢,智力發育遲緩,TRFIA法是對其進行早期診斷的有效方法[23～25]。
2、唐氏綜合癥的檢測
近幾年，運用TRFIA 技術，利用孕婦血清生化標記物進行產前唐氏癥篩查，作為一種無創傷性檢查手段[26]。研究妊娠相關血漿蛋白A 在早孕婦女血清中的變化對唐氏綜合癥,流產的早期診斷和監測有較高的價值[27]。
3、在腫瘤學方面的應用
通過測定腫瘤標志物水平，來檢測腫瘤疾病。比如甲胎蛋白（28）、癌胚抗原（29）、糖類抗原CA125（30）和前列腺特異性抗原PSA[31]等。
4、用于病原微生物抗原抗體的檢測
TRIFA已經廣泛的應用于各種傳染性疾病的檢測和研究中，比如，甲肝病毒（HA）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒、腦炎病毒、SARS等流感病毒、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒、風疹病毒、免疫缺陷病病毒及出血熱病毒等[32～37]。
五、時間分辨熒光免疫分析法在食品安全上的應用
1、食品中致病微生物的檢測
Escherichia coli O157:H7會引起出血性大腸炎和溶血性尿毒癥綜合癥。Yu 等[38]運用TRFIA 技術測定蘋果汁中Escherichia coli O157:H7 的數量。應用一種類似夾心ELISA 的方法，以免疫磁珠為固相載體，用Eu 標記抗體，最終通過Eu 激發的熒光用TRFIA 分析檢測儀檢測熒光強度，Escherichia coli O157:H7含量與熒光強度成一定線性關系。最低檢測量達到101CFU/ml，并且當大量的Escherichia coli K-12共存時，也不會影響Escherichia coli O157:H7的檢測靈敏度，證明用TRFIA技術特異性高，能夠針對不同菌種進行檢測，而不互相干擾。檢測時間短，直接檢測時間只要2 h 。
2、食品中生物毒素的檢測
Lei 等[39]利用一種類似于間接競爭ELISA 的TRFIA技術對微囊藻毒素進行檢測。檢測范圍為0.01ng/m到l10ng/ml，靈敏度是ELISA 的20 倍，大大優于ELISA 方法，并且有很高的重現性和準確性。黃飚等[ 4 0 ]也利用TRFIA 技術建立快速的高靈敏度的赭曲霉毒素A(OTA)全自動檢測方法。研究表明，OTA-TRFIA 是目前報道的O T A 檢測中最靈敏的方法，該分析方法穩定性好，可測范圍寬，具有很好的應用前景。
3、食品中有害金屬物質的檢測
于水等利用激光- 時間分辨熒光建立了Al、Zn、Mg、Cd的測定方法。Dang等[41]利用激光-時間分辨熒光分析儀對微量物質進行檢測，該方法干擾小，靈敏度高，可用于食品和環境中有害金屬物質，功能因子以及有害物質的微量檢測。
六、TRFIA 在食品安全檢測中的發展前景
隨著人們對食品安全的要求越來越高，國際社會上對食品中有毒有害物質的檢測越來越嚴格，各種有毒有害物質的限量標準也在不斷提高。近年來我國食品被進口國拒絕、扣留、退貨、索賠和終止合同的事件時有發生，1999 年8 月至2000 年1 月，我國共有634 批出口食品，因不符合美國政府的技術法規，遭到美國食品和藥物管理局（FAD）扣留。更加突出的問題為：我國畜禽肉(特別是凍雞)長期因獸藥殘留問題而出口歐盟受阻；茶葉由于農藥殘留問題而出口多國受阻；輸韓鴨肉因含有禽流感病毒而受阻；醬油由于氯丙醇污染問題而影響了向歐盟和其他國家出口。為了解決出口食品受阻和嚴格控制有害進口食品進入國門，保證人民的身體健康，必須找到靈敏準確的檢測方法。
TRFIA 是隨著免疫分析和化學分析的發展而成孰起來的一種新的檢測方法。作為一種靈敏度高、特異性好、安全的超微量分析測定方法，目前已廣泛而成熟地應用在臨床醫學領域，同時也在食品安全領域嶄露頭角，用于快速檢測食品中的大腸桿菌O157:H7、赭曲霉毒素A 、微囊藻毒素和有害金屬等。相信隨著檢測設備的廣泛應用和各種檢測試劑盒的不斷開發，TRFIA 將在食品安全領域發揮更大的作用。
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