核酸透射電鏡樣品制備實驗——核酸樣品

很多球狀蛋白均能在水溶液或鹽溶液的表面形成不溶的變性薄膜，在適當的條件下這一薄膜可以成為單分子層，由伸展的肽鏈構成為一個分子網。當核酸分子與該蛋白質單分子膜作用時會由于蛋白質的氨基酸堿性側鏈基團的作用，使得核酸從三維空間結構的溶液構型吸附于肽鏈網而轉化為二維空間的構型，并從形態到結構均能保持一定程度的完整性。最后將吸附有核酸分子的蛋白質單分子膜轉移到載膜上，用負染等方法增加樣品的反差后置電鏡觀察。

質粒 pBR322

堿性球狀蛋白溶液醋酸鐵乙二胺四乙酸二鈉蒸餾水滑石粉無水乙醇醋酸鈾乙醇溶液

微量注射器移液槍載玻片平皿有支持膜的載網鑷子濾紙

1. 將質粒 pBR322 與一堿性球狀蛋白溶液（一般為細胞色素 c）混合。使濃度分別達到 0.5～2 mg/ml 和 0.1 mg/ml，并加入終濃度為 0.5～1 mol/L 的醋酸鐵和 1 mmol/L 的乙二胺四乙酸二鈉，成為展開溶液， pH 為 7.5。

2. 在一干凈的平皿中注入一定下相溶液（蒸餾水或 0.1～0.5mol/L 的醋酸鐵溶液），并在液面上加入少量滑石粉。將一干凈載玻片斜放于平皿中，用微量注射器或移液槍吸取 50 μl 的展開溶液，在離下相溶液表面約 1 cm 左右的載玻片上前后擺動，滴于載玻片的表面，此時可看到滑石粉層后退，說明蛋白質單分子膜逐漸形成，整個過程約需 2～3 min。

3. 單分子膜形成后，用電鏡銀子取一覆有支持膜的載網，使支持膜朝下，放置于離單分子膜前沿 1 cm 或距離載玻片 0.5 cm 的膜表面上，并用鑷子即刻撈起。單分子膜即吸附于支持膜上，多余的液體可用小片濾紙吸去，也可將載網直接漂浮于無水乙醇中 10～30 s。

4. 將載有單分子膜的載網置于 10^-3～10^-5mol/L 的醋酸鈾乙醇溶液中染色約 30 s（此步可在用乙醇脫水時同時進行），或用旋轉投影的方法將金屬噴鍍于核酸樣品的表面。也可將二種方法結合起來，在染色后再進行投影，其效果有時比單獨使用一種方法更好一些。

1. 在單分子膜形成時，整個裝置最好用玻璃罩等物蓋住，以防操作人員的呼吸和旁人走動等引起氣流的影響以及灰塵等臟物的污染。

2. 在展開溶液中可適量加入一些與核酸量相差不過懸殊的指示標本，如煙草花葉病病毒等，以利于鑒定單分子膜的展開及后面轉移的好壞。

3. 在蛋白形成單分子膜時，溶液中的核酸分子也同時分布于蛋白質基膜中間，并略受蛋白質肽鏈的包裹。理論計算及實驗證明，當 1 mg 的蛋白質展開成良好的單分子膜時，其面積約為 1 m²。因而可根據最后形成的單分子膜面積的大小估計其好壞程度。如果面積過小。說明形成的膜并非單分子層，因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危險，使整個核酸分子消失或反差變壞。

4. 載玻片傾斜的角度決定了展開液下滑至下相溶液的速度，并對單分子膜的形成質量有影響，經驗證明傾斜度以 15° 左右為宜。