棉花耐鹽相關基因GhVP的表達及功能分析

土壤鹽漬化是世界范圍內限制農作物產量和品質的重大問題。棉花是改良鹽堿地的先鋒作物。培育棉花耐鹽品種，開發利用大面積鹽堿地是棉花種植的必然趨勢，通過分子生物學手段挖掘棉花耐鹽相關基因，創新棉花種質資源，對棉花耐鹽性研究尤為重要。

系統進化分析表明 GhVP 與鹽生植物鹽爪爪、灰綠藜的親緣關系最近，進一步說明GhVP 基因在陸地棉適應鹽脅迫機制中發揮了積極作用。關于 GhVP 的報道已經有很多，都證明這個基因與植物耐鹽性有密切的關系，它在鹽脅迫代謝網絡中發揮重要作用。但對此基因在棉花上的定位和表達分析卻未見報道。在真核細胞和高等植物中，采用綠色熒光蛋白 GFP 結合使用激光共聚焦顯微鏡，來研究細胞內蛋白質的表達，從而實現對目標基因進行亞細胞定位是 1 種常用的手段。

中國農業科學院棉花研究所立題《棉花耐鹽相關基因 GhVP 的表達及功能分析》，針對棉花 GhVP 基因的洋蔥表皮亞細胞定位和棉花花粉瞬時表達進行了研究，在進一步探索該基因的分子機制以及耐鹽新材料創制提供了理論依據。此次研究中，課題組創新性采用棉花花粉進行瞬時表達研究，縮短了實驗周期，更快速獲得轉化植株，為基因功能的研究開辟了新思路。

GhVP 基因的亞細胞定位

將構建好的 pBI121-GhVP∷GFP 載體用金粉包裹，把金粉包裹好的質粒加入基因槍 GDS-80 轟擊洋蔥內表皮細胞， 在激光共聚焦顯微鏡下觀察。可以看出，空載體 pBI121-GFP 轉化洋蔥表皮后， 在整個洋蔥細胞均能看到綠色熒光。pBI121-GhVP∷GFP 轉化洋蔥后，VP 蛋白定位于洋蔥表皮細胞的細胞膜上，在玻片上加蔗糖，待質壁分離后，GhVP 蛋白在洋蔥表皮細胞的細胞膜和細胞間質中均有分布（圖3）。結果表明 GhVP 蛋白是 1 個跨膜蛋白， 與細胞質一起維持細胞膨壓，可以調節細胞內外的離子平衡，促使細胞達到穩態。

棉花花粉的瞬時表達

由于棉花花粉有自發熒光現象，根據實驗室前期研究結果，選擇 3 種自發熒光弱的棉花材料 GZ-2，Y-2067 和ZA-23，收集 3 種材料的花粉，將金粉包裹好的 pBI121-GhVP∷GFP 質粒加入基因槍 GDS-80，轟擊棉花花粉，在激光共聚焦顯微鏡下（目鏡 40×）觀察單個花粉顆粒，結果（圖4）與前期研究結果相一致，3 種花粉的綠色熒光都明顯增強，證明 GhVP 基因在棉花花粉中得到了表達。這為 GhVP 基因在棉花中表達研究和下一步轉基因試驗提供了理論基礎。

GhVP 基因在棉花中的組織特異性表達

分析熒光定量結果（圖5）顯示，GhVP 基因在棉花根、葉、莖、花和纖維中均表達，而且表達差異較大。以根部的表達量為對照，可以看出 GhVP 基因在葉片中的表達量最高，是根部表達量的 3～4 倍，莖中的表達量是根部的 2 倍，而 GhVP 基因在花和纖維中的表達量相對較低。說明 GhVP 基因主要在棉花葉片中表達，并發揮功能，具有不同組織優勢表達的特性。

結論

本研究從棉花中成功克隆得到 GhVP 基因，構建 pBI121-GhVP∷GFP 熒光表達載體。亞細胞定位結果顯示，GhVP 主要位于細胞質膜上。同時構建 pBI121-GhVP∷GFP 熒光表達載體轉化棉花花粉，結果花粉的綠色熒光增強，表明該基因表達量增加。同時對該基因在棉花不同組織（根、莖、葉、花和纖維）中的表達量差異進行分析。結果顯示該基因在葉片中表達量最高，在纖維中最低，具有表達組織特異性，該結果也暗示VP 基因主要發揮作用的位置不同，與基因功能密切相關。

V-PPase 是 1 類離子轉運酶。自從在 1975 年從甜菜中提取到 VPP 以來，已經相繼從多種不同植物中克隆得到了 VPP 基因。目前對 VPP 基因的功能及轉基因分析都做了許多研究，然而 VPP 基因在棉花中的具體功能還需進一步深入研究。將外源基因轉入受體植物體內，是遺傳學上研究基因功能和獲得遺傳修飾新功能的重要手段。農桿菌介導法是目前最常用的方法之一，但是此方法的轉化效率不高，且費時費力。本研究采用棉花花粉進行瞬時表達研究，可以縮短周期，更快速獲得轉化植株，為基因功能的研究開辟了新思路。本研究基于棉花焦磷酸酶基因 GhVP 的亞細胞定位和瞬時表達研究，結合該基因在不同組織中的表達差異分析，表明 GhVP 基因主要在葉片的細胞質膜上發揮作用，可能與棉花抗逆脅迫有重要關系。同時也為棉花花粉的瞬時表達研究提供了依據，為進一步進行基因功能的研究開辟了新思路。

參考資料

趙小潔, 穆敏, 陸許可,等. 棉花耐鹽相關基因GhVP的表達及功能分析[J]. 棉花學報, 2016, 28(2):122-128.