在實際操作中，點樣后的濾紙一端浸沒于流動相液面之下，由于毛細作用，有機相即流動相開始從濾紙的一端向另一端滲透擴展。當流動相（有機相）沿濾紙經點樣處時，樣品點上的溶質在水和有機相之間不斷進行分配，一部分樣品離開原點隨流動相移動，進入無溶質區，此時又重新分配，一部分溶質由流動相進入固定相（水相）。隨著流動相的不斷移動，因樣品中各種不同的溶質組分有不同的分配系數，移動速率也不一樣，所以各種不同的部分按其各自的分配系數不斷進行分配，并沿著流動相流動的方向移動，從而使樣品中各組分得到分離和純化。
紙層析對混合物進行分離時，發生兩種作用：第一種是溶質在結合于纖維上的水與流過濾紙的有機相進行分配（即液—液分離）；第二種是濾紙纖維對溶質的吸附及溶質溶解于流動相的不同分配比進行分配（即固—液分配）。雖然混合物的彼此分離是這兩種因素共同作用的結果。