氮艙減壓法裂解培養細胞實驗

通過來自增壓艙中的氮氣減壓膨脹來破碎細胞是一種快速、有效的細胞和組織的勻漿方法，能釋放完整的細胞器和制備細胞膜。該方法的原理很簡單：細胞放在一個壓力艙中，在高壓下（約5500kPa，相當于800psi)氮氣首先被溶解在細胞中，當壓力突然消失時，氮從溶液中迅速氣化，并引起細胞膜的拉伸和擴展，使之破裂，釋放出細胞內容物。氮艙減壓法適用于哺乳動物和植物細胞，以及一些細胞壁經過處理的細菌。但是這種方法在裂解酵母、真菌孢子或有堅硬細胞壁的細胞時效率較低。

動物細胞或組織

勻漿溶液 PBS

細胞破碎艙 細胞刮刀

1確保出口關閉（但不要過緊），并把裝置放入冰中預冷（如果有必要）

②準備要破碎的細胞或組織。

貼壁培養的細胞：用磷酸鹽緩沖液（PBS)溫和地洗細胞2?3次，用橡膠細胞刮刀，把細胞從培養器皿中刮到PBS溶液中。非貼壁培養的細胞：400g離心10min，收集細胞，用PBS洗細胞2?3次。動物組織：用機械勻漿器，紗網或過濾篩過濾，將組織絞碎。

③4C條件下480g離心5min收集細胞。

④去掉上清液，用10倍體積（約15ml)的勻漿溶液重懸細胞，然后轉移上清至一個塑料燒杯（含有磁力攪拌棒）中，溫和地攪動、混勻，以獲得均一的懸浮液。

⑤從冷卻的細胞破碎艙中旋轉、托出過濾支架。

⑥在細胞破碎艙中加入15ml的細胞懸浮液。若體積較大，可以用較大型號的破碎艙，也可以使用其他的氮氣壓力艙。

⑦復位過濾支架。

⑧通過擰緊壓力艙頂部的螺絲，使之與無氧氮源連接起來，該螺絲應該已經連接在氮源上，只需一個扳手即可。

⑨最好在低溫下更換壓力艙。

⑩讓氮氣從汽缸流人破碎艙，加壓到預期值。必須有壓力計顯TK壓力艙內的壓力。所需的壓力取決于要破壞的細胞的類型。一般使用的壓力為：

a.KB(人類口腔上皮癌細胞）細胞500psi(相當于3.45MPa)

b.大鼠肝細胞500psi(相當于3.45MPa)

c.雞紅細胞1000psi(相當于6.9MPa)

每一次實驗，步驟⑩必須選擇最合適的預期值。一般，低壓能更大程度地獲得完整的細胞器，而高壓則使勻漿更為徹底。難以裂解的細胞則需要多次處理，以獲得更徹底的勻漿。破碎不同細胞所需的有效壓力在表3.6中示出。

注意：沒有經驗的工作者處理高壓氣體時必須在使用汽缸前尋求專家的幫助。

?將加壓裝置至少平衡30min，以便使氮氣溶解并在細胞內達到平衡。在這期間用磁力攪拌器溫和地攪動1?2次，或間斷地溫和晃動，以確保細胞處在均一的懸浮液中。

?把收集容器（如燒杯）放在出口旁，并冰浴。

?維持壓力裝置的工作狀態（保持壓力），緩慢打開出口，直到細胞懸浮液開始流人已經冷卻的收集容器，在所有的懸浮液流盡之前要維持壓力。合理的流速是每秒3?10滴。當幵始流出泡沫，表明裝置內的液體幾乎流完，同時會伴有微弱嘶嘶聲。隨著壓力的釋放，細胞就會破裂，但是通過出口的微孔也會幫助細胞裂解。

注意：勻漿液由高壓推出，因此操作時必須小心，尤其是當樣品中含有危險物質時。由于有可能產生氣態溶膠，該程序必須在保護通風櫥內進行。

?在對勻漿液離心或是后續操作之前，必須先溫和地攪動，以消退泡沫。

?關閉出口，但不要擰得太緊。

?關閉氮源。所需的有效壓力在表3.6中示出。

注意：沒有經驗的工作者處理高壓氣體時必須在使用汽缸前尋求專家的幫助

氮艙減壓法的特征如下：

①這是一種勻漿或分離細胞組分的溫和方式，因為它施加于酶和亞細胞組分的化學和物理壓力與其他超聲波和機械勻漿的方式相比，是最小的。例如，從大多數類型的細胞中均可釋放出功能完整的核和線粒體。

②與許多依賴壓力和摩擦力的細胞裂解方法不同的是，氮減壓膨脹法不會產生熱，因為這種方法通過隔熱膨脹來冷卻樣品，而不是加熱它。因而，蛋白和細胞器沒有熱損傷。

③通過使用惰性氣體氮氣，可以保護任何不穩定的組分免于被氧化，而且氮氣不會改變懸浮介質的pH值。

④該過程快速并且均一，因為在每個細胞上和整個樣品中施加了同樣的破壞力，保證可重復產生無細胞的勻漿液。

⑤大多數的市售產品都適用于很大的樣品體積范圍（如從約1ml到1L或更多）。注意：因為要產生高壓，應在保護遮蔽物后進行操作。