水質對HPLC分析的影響

　　簡介：

　　優化的高效液相色譜法分析需要高純度溶劑和試劑。同時，在流動相準備階段，色譜柱中鹽和有機溶劑的選擇十分謹慎，所以水質是非常重要的。在洗脫液中，中痕量有機物的存在可能會導致長期不好的結果。隨著時間推移，柱效可能會阻塞，導致分辨率降低，峰拖尾。大量實驗表明，水中的有機物可能極大地影響液相色譜-質譜分析的結果。有機污染物易電離，就會與分析物結合，從而影響實驗結果。

　　研究的目的：

　　本研究旨在探討水質對高效液相色譜法分析的影響。首先，使用去離子的水、 雙蒸餾水，HPLC 級別瓶裝水、 新鮮超純水和存儲超純水進行基線比較。此外，用七種藥物混合物利用梯度的乙腈與市面上的瓶裝水、新鮮純凈的水這兩種不同水質作前處理流動相，反復進行分析 (1310 次)，進行色譜圖比較。

　　分析方法：

　　1. 高效液相色譜基線研究：

　　儀器：高效液相色譜系統 Alliance? 2695。檢測器: PDA 模型 2996，設置在 210 nm

　　列: X Terra ? MS (C18，2.1 毫米 x 150 毫米 x 2.5 μ m)

　　流動相：高效液相色譜級乙腈 (J.T.Baker)，高效液相色譜級瓶裝水 (Chromanorm，Prolabo)，雙蒸水，Milli-Q Gradient A10 (Millipore)所制造的新鮮水，水凈化系統中在 UV 燈氧化之前所制備的水。

　　程序

　　樣品制備: 在 HPLC 分析之前 60 毫升的水樣品被富集在 X Terra MS (C18 ,4.6 x 30 毫米 x 3.5μm)

　　按照以下的梯度洗脫 (水: 乙腈):

　　100%到 0%水中 30 分鐘

　　再 80%水 10 分鐘

　　ESI + 實驗使用 Waters Micromass? ZQ?2000

　　2. 藥物混合料研究:

　　儀器：高效液相色譜系統: Waters 510 HPLC 色譜泵；717 加自動進樣器；9966 光電二極管陣列，設置在190-400 毫微米的探測器；列: SymmetryShield RP18 (Waters), 3.5 μ m，4.6 x 150 毫米。

　　藥物混合

　　以下按照色譜藥品標準來自 Alltech 濃度 1 毫克/毫升，

　　在甲醇溶解: (1) 對乙酰氨基酚、 乙酰唑胺 (2)、 苯巴比妥 (3)、卡馬西平 (4)、苯妥英 (5)、 (6) 速可和萘丁美酮 (7)。混合物制備每種藥品含 0.200 μ g/m l 的。

　　流動相：高效液相色譜級乙腈 (Fisher)，HPLC 級瓶裝水 (Fisher) 和 Milli-Q Gradient A10 (Millipore)并通過 0.22 微米的 Millipak ?所制造的新鮮水以及水凈化系統中在 UV 燈氧化之前所制備的水。

　　程序

　　25 μ L 注射藥物混合通過 0.45 μ m 13 毫米 Millex ?-LCR 過濾裝置過濾。

　　按照以下的梯度洗脫 (水: 乙腈)

　　組分的混合物的分離:

　　80%至 30%水的 15 分鐘

　　30%至 80%水 1 分鐘，再進行 80%水 4 分鐘

　　水的純化：

　　自來水通過多種純化技術的組合生產出純水：

　　需求:用于實驗用水的超純水需要達到(電阻率是在 18.2 MW.cm25 ° C)，并且總有機碳 (TOC)包含少于 5ppb

　　結果和討論--基線研究

　　長久以來，雙蒸水在實驗室"黃金標準"用水，但現在已知它含有有機污染物: 某些污染物可能隨之水蒸汽蒸發，而某些則殘留在水中。這可能會導致高效液相色譜基線背景強烈。

　　高效液相色譜級瓶裝水還可能包含某些有機污染物 (圖 1)

　　通過 LC-MS，我們可以看到蒸餾水和瓶裝水中有機污染物的存在 (圖 2)。而在超純水中，紫外線光氧化是有效的消除有機物。

　　將一個裝有超純水的玻璃瓶暴露在實驗室中。在圖 3 可以看到污染物在水中的表現。超純水是一種優良的溶劑，很容易地被實驗室大氣層中存在有機物質所污染。

　　結果和討論--藥物混合物研究

　　使用不同水源作為流動相利用高效液相色譜法分離 7 藥物，反復重復實驗 1310 次(圖 4)。

　　圖 4，以 HPLC 級瓶裝水和乙腈作為流動相，在 214nm 藥物混合物色譜圖 (1) 對乙酰氨基酚、 乙酰唑胺(2)、 苯巴比妥 (3)、卡馬西平 (4)、苯妥英 (5)、 (6) 速可和萘丁美酮 (7)

　　當 HPLC 級瓶裝的水用于制備流動相，基線漂移隨著實驗次數的增加而發生變化 (圖 5A)。而當時使用超純水基線趨于穩定 (圖 5B)。

　　基線漂移同樣出現在 254 nm 時采用 HPLC 級瓶裝水作為流動相 (圖 6A 和 B)。當 HPLC 級瓶裝水，隨著時間的推移，大約在洗脫的 5 分鐘時鬼峰出現。(圖 6A)。而實驗超純水并沒有出現鬼峰(圖 6B)。

　　鬼峰可能是由于集中在色譜填料上的有機污染物被釋放。基線漂移可能是由于瓶裝水所釋放出的有機雜質所帶入的。

　　使用新鮮帶有的極其少量污染物（有機物含量極低）的超純水優于 HPLC 級瓶裝水，即使在 1310 注射后仍能保證穩定的基線和沒有雜峰的出現。

　　總結：

　　使用高效的預處理系統，通過 UV 光氧化處理，能有效去除水中有機雜質，提供優質的超純水，相比較瓶裝 HPLC 級別瓶裝水，這種高質量水的使用大大減少基線漂移和限制高相液相色譜法中的雜峰出現。使用新鮮生產純水且低 TOC (< 5ppb) 作為流動相有助于達到并維持良好的色譜性能。這種實驗用水非常適合于靈敏度高的方法，如液相色譜-質譜。