沃特世推出AccQ?Tag?Ultra氨基酸專用分析方案

專用氨基酸分析方案用于細胞培養過程監控以及確定蛋白質結構

　　簡介

　　沃特世近期推出的AccQ?Tag? Ultra氨基酸專用分析方案有更高的分離度和靈敏度，確保用戶得到精確可靠的氨基酸定性和定量分析結果。這個方案來源于已經被廣泛使用和認可的AccQ?Tag柱前衍生方法，得到的衍生物用沃特世ACQUITY UPLC?（超高效液相色譜）系統進行分離，可達到最佳分離度和更高的靈敏度，分析時間更短。系統控制，數據采集、處理和報告由Empower?軟件進行。這是一個整體解決方案，針對不同應用的儀器方法和數據處理方法都已經在應用光盤內預先設定好，直接調用即可獲得進行分析。

　　UPLC氨基酸分析應用方案

　　設計重點與成功分析的關鍵

　　? 所有氨基酸都達到基線分離

　　? 對每個峰進行準確定性

　　? 衍生反應副產物同氨基酸衍生物可以完全分離

　　? 3個數量級的動態線性范圍，保證對不同濃度水平的氨基酸準確定量

　　? 足夠的電噴霧離子化靈敏度與穩定性

　　衍生反應過程示意圖

圖1氨基酸與AQC的衍生反應示意圖

　　使用AccQ?Tag Ultra衍生試劑（6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯）對氨基酸進行衍生，伯氨基酸和仲氨基酸均可快速、定量完成衍生反應，操作簡便，衍生反應還可以自動化進行（batch wise）。

　　? 衍生反應在大量水溶液存在的條件下進行，對不同緩沖液體系和不同組成的樣品均可得到可靠的結果

　　? 樣品無需進行特殊處理，也不需要真空干燥或提取

　　? 樣品經衍生后的產物可穩定保存幾天

　　? 過量的衍生試劑可在一分鐘內水解為不干擾測定的AMQ，因此不需要去除過量衍生試劑的操作

　　? 衍生反應副產物同氨基酸衍生物可以通過色譜達到完全分離

圖2A 氨基酸標樣的色譜圖（柱上濃度10 pmol），包括穩定硫化氨基酸的一般產物，圖中顯示了氧化與烷基化的結果。

　　為監測細胞培養過程中發酵液的成分，或者對發酵用培養基進行質量控制，需要分離其它種類的氨基酸。與標準分析方法相比，分析細胞培養液中的氨基酸在分析方法的參數設置上有些不同：AccQ?Tag Ultra洗脫劑A（濃縮液）的稀釋倍數不同，還需要較高的柱溫。其它參數相同。

圖2B 細胞培養液中氨基酸標準品的色譜圖（柱上濃度10 pmol）

　　蛋白結構鑒定

　　氨基酸組成分析

　　本方法可用于在蛋白質結構分析中確定蛋白質的氨基酸組成，直接使用標準方法即可得到分析結果。

圖3A 促卵泡刺激素（hFSH）水解產物分析

圖3B經還原和烷基化處理后的促卵泡刺激素（hFSH）水解產物分析

圖3C 經過氧甲酸氧化處理后的促卵泡刺激素（hFSH）分析

　　蛋白濃度檢測

　　最終的分析結果可以任何常見單位表示，包括每種氨基酸的重量，每次進樣的氨基酸總重量和所進樣的蛋白質重量是相等的，通過已知的稀釋比例即可計算出水解反應的蛋白質質量和樣品中蛋白質的濃度。

　　細胞培養過程監控

　　AccQ●Tag Ultra氨基酸分析方案可用于檢測細胞培養過程中氨基酸的濃度變化，這對于優化細胞生長條件至關重要。僅僅需要很少的細胞培養液，且不需要任何樣品制備過程即可進行分析。

圖4A &B 在第1天、第3天和第6天的細胞培養液中氨基酸分析圖譜。上圖為色譜圖全貌，下圖為部分放大圖譜

　　方法與ESI-MS完全兼容

　　對于基質復雜的樣品，如細胞培養液中的氨基酸分析，通常需要經過樣品前處理后才可進行分析。沃特世AccQ●Tag Ultra方法可以直接對細胞培養液或培養基進行分析，且靈敏度很高。小量樣品即可得到分析結果，圖中每個色譜圖代表了25 nL培養液的分析結果，細胞培養液中的其它組分對氨基酸分析沒有任何影響。

　　對氨基酸鹽生物進行準確的定量分析有助于監測生物藥物生產過程中的細胞代謝情況。表1顯示了隨著時間推移不同氨基酸在細胞培養過程中的濃度變化情況，可以看出有的氨基酸濃度增加，有的減少，有的維持不變，在第7天補加了Gln（谷氨酰胺），可以非常清楚地看出氨基酸組成變化的情況。

圖表1細胞培養過程中不同氨基酸濃度隨時間的變化圖標

圖5氨基酸衍生物分析的MS TIC譜圖

　　UPLC?氨基酸分析方案可以與不同的檢測器匹配，包括紫外、二極管陣列和熒光檢測，同時，此方法使用的流動相與ESI MS檢測完全兼容。如果您需要在常規分析中進行氨基酸峰的確證或者分析pmol以下濃度水平的氨基酸檢測，光學檢測器可以完全達到要求。但在以下應用中ESI MS檢測是十分有用的：

　　? 通過分子量對氨基酸進行確證

　　? 分析方法的確證

　　? 用于檢測樣品中未知或未預料到的色譜峰

　　結論

　　? UPLC氨基酸分析方案是一套可靠的交鑰匙方案， 可用于蛋白質水解產物分析與細胞培養液監控，且都有預先設好的標準方法；

　　? 可在很短時間內得出精確的分析結果，用于蛋白質結構分析，包括對含硫氨基酸的分析；同時分析結果還可用于確定蛋白質濃度；

　　? 可監測在生物藥物生產過程中，細胞培養液中氨基酸濃度隨細胞生長時間的變化；

　　? 此方案與ESI MS完全兼容。