液相色譜在線凈化電噴霧串聯質譜應用（一）

液相色譜在線凈化-電噴霧串聯質譜測定水產品中大環內酯和林可胺類藥物殘留

摘 要：建立了水產品中大環內酯類抗生素[紅霉素（ERM）、羅紅霉素（ROM）、替米卡星（TIL）、泰樂菌素（T Y L ） 、北里霉素（K I T ） 、交沙霉素（JOS）、竹桃霉素（OLM）、螺旋霉素Ⅰ（SPM-Ⅰ）和林可胺類（林可霉素(LIN)和氯林可霉素（CLD））的高效液相色譜－電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS/MS)檢測方法。樣品經提取后、反相液相色譜分離凈化后進行質譜分析, 在選擇反應監測模式(SRM) 下進行特征母-子離子對信號采集。根據保留時間和母離子及兩個特征子離子信息進行定性分析，以基峰離子進行定量。大環內酯類殘留的檢測限( S/N = 3) 為 0.1-0.2 μg/Kg，定量限為 1.0 μg/Kg，在1.0～200 ng/ mL時峰強度與質量濃度的線性關系良好( R2 > 0.99)。在蝦、鰻魚和帶魚三種基質中1.0、2.0、10.0 μg/kg三個添加水平下, 除個別藥物外，藥物的平均回收率范圍為64 %～114 %，日內相對標準偏差小于11.7 %。結果表明，該法簡單、靈敏，特異性強，適用于各種水產品中大環內酯類殘留的分析確證。

關鍵字：大環內酯類藥物，水產品，殘留，在線凈化，LC-MS/MS

1.前言

大環內酯類抗生素（macrolide antibiotics ,MALs）是利用放線桿菌或小單孢菌生產的具有大環狀內酯環的抗生素的總稱，對革蘭氏陽性菌和支原體有較強的抑制能力。林可胺類藥物(lincosamides)是具有抗革陽性需氧菌、和革蘭陽性或陰性厭氧菌活性的抗生素, 通常用于需氧及厭氧混合感染的治療。隨著更多MALs的出現和商品化，MALs已經廣泛用于細菌性和支原體感染的化學治療[1,2]。林可胺類藥物常見的有林可霉素和氯林可霉素，氯林可霉素比林可霉素具有更高的活性。由于食品中的藥物或其代謝產物都會有獨特的變異性反應，藥物在體內蓄積達到一定的濃度，對消費者構成潛在威脅，許多國家對食品大環內酯類藥物設定了相應限量要求，要求每種藥物的殘留限量不超過10μg/kg。目前報道的檢測大環內酯類和林可胺類的檢測方法主要有高效液相色譜法[3,4]、氣/質聯用法[2]、液/質聯用法（LC/MS）[5-12]。LC/MS是目前藥物殘留分析中理想方法，它既可用于殘留的確證分析，又能作為一種通用的高效能測定方法。有文獻報道同時檢測蜂蜜中泰樂菌素和林可霉素[13]，但國內尚未見液/質聯用法測定水產品中大環內酯類和林可胺類藥物殘留的研究報道。固相萃取方法既可用于復雜樣品中微量或痕量目標化合物的提取、又可用于凈化、濃縮或富集，是目前獸藥殘留分析樣品前處理中的主流技術。水產品是我國重要的出口農產品之一，也一直是各國對各種藥物殘留檢測的重點產品。水產品的品種很多，實驗中選取典型的蝦、淡水的鰻魚和海水的帶魚研究。本實驗中對水產品試樣用乙腈提取后，濃縮后定容，正己烷脫脂凈化，液相色譜在線凈化，串聯質譜儀測定。方法簡單快速，實用性強。

2. 實驗部分

2.1試劑和材料

二次去離子水，甲醇（色譜純），正己烷（色譜純）。替米卡星、竹桃霉素、紅霉素、羅紅霉素、泰樂菌素、北里霉素、螺旋霉素Ⅰ、交沙霉素、林可霉素和氯林可霉素標準物：購自sigma或Dr. E公司，純度≥95%

藥物標準儲備溶液：1.0 mg/mL。準確稱取適量的藥物標準物質，用甲醇配成1.0 mg/mL的標準儲備液。儲備液儲存在4℃冰箱中，可使用六個月。

藥物標準工作溶液：用空白樣品提取液分別配成大環內酯類藥物濃度為2 ng/mL 5 ng/mL,10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL，200 ng/mL標準工作溶液，標準工作溶液在4℃保存，可使用兩周。

2.2儀器

液質聯用儀由Surveyor液相色譜系統和Thermo Fisher TSQQuantum Ultra 三重四極桿串聯質譜[電噴霧電離源( ESI)]構成。液相系統包括自動進樣器（Autosampler 1.3），質譜泵（MS Pump 2.0）軟件使用Xcalibur 1.4版。真空氮氣吹干儀( Zymark 公司，USA)，Milli Q去離子水發生器(Millipore 公司,USA)。

2.3試樣的制備與保存

2.3.1試樣的制備

取具有代表性的可食部分500 g，充分攪碎，混勻，密封，并做上標記，于-18℃冷凍保存。制樣過程中，應防止樣品收到污染而發生殘留物含量的變化。

2.3.2提取

準確稱取水產品試樣（5.00±0.05g），置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋混勻后，室溫下超聲10min，加入約5 g無水硫酸鈉，渦旋后靜置10 min。渦旋靜置10min，8000 r/min離心5 min，將上層有機相轉移至梨形瓶中。再用10 mL乙腈重復提取一次，合并上層有機相。在40℃下，氮氣吹至干。用1.0 mL3:7甲醇水溶液渦旋溶解殘渣后再加入和0.5 mL正己烷。溶液渦旋30 s后，16000 r/min離心5 min，取適量下層溶液經0.22 μm濾膜過濾后，供LC-MS/MS法測定

2.3.3測定

液相色譜條件

色譜柱：Varian Polaris C18-A, 5 μm, 150 mm×2.1 mm i.d；流動相：0.1%甲酸水溶液 (A)＋甲醇（B）；流速：0.25mL/min；梯度：0～3.0 min 10% ～ 60% B, 3.0～4.0 min60% B, 4.0～8.0 min 600% ～ 90% B，8.0～11.0 min 90% B，11.1～13.0 min 10% B；柱溫：室溫；進樣量：25 μL。

串聯四極桿質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇反應檢測；電噴霧電壓：-4500V；霧化氣壓力：0.060 Mpa；氣簾氣壓力：0.060 Mpa；輔助氣流速：5 L/min；離子源溫度：350℃；數據采集參數：Scan width: 0.002 amu； Scan time＝0.02 s (Ms2)。在線切換閥：0-5.5 min 至廢液，5.5-11.0 min 進質譜分析，11.0至廢液。

3.結果與討論

3.1 MS/MS

林可胺類的林可霉素和氯林可霉素都有一個共同的m/z126的子離子，質譜裂分機理在文獻中已經討論過。大環內酯類共同的特征子離子為m/z 174或158，兩者相差一個氧原子。由于大環內酯類藥物在母環上穿在差異，母環相同的竹桃霉素，紅霉素和羅紅霉素都有m/z158的子離子，另外5種具有相同母環的藥物具有m/z174的子離子。根據歐盟EC657指令的規定，對于液-質聯用的方法，一個母離子（1.0識別點）加兩個特征子離子（2×1.5識別點）可以滿足對一個被分析物4個識別點的定性確證的要求。表1列出了八種大環內酯類和兩種林可胺類化合物的母離子、子離子及其碰撞能量。

3.2 樣品提取

水產品的基質差異比較大，有甲殼類，有淡水的，有海水的。在各種基質中，實驗中選取蝦作為甲殼類的典型基質，淡水中選取脂肪含量高的鰻魚作為典型基質，海水中選取帶魚作為典型基質進行加標實驗。樣品提取中，對于大環內酯類化合物，提取方法主要為有機溶劑提取后，固相萃取凈化后再進樣分析。通常采用的固相萃取柱的類型為反相的C18或HLB，或者陽離子交換的MCX或SCX。在使用陽離子交換時，需要條件pH至酸性，而酸性條件下一些大環內酯藥物如泰樂菌素會分解。實驗中比較了HLB和MCX固相萃取柱，HLB柱上，所有的大環內酯類藥物的回收都在70%以上。而在陽離子交換柱MCX上，紅霉素、北里霉素幾乎沒有回收，泰樂菌素和螺旋霉素回收率不到30%。而反相機理的HLB柱與色譜分離中C18柱的分離機理相同，主要是去掉不保留的鹽，其它低保留的雜質和高保留在柱上用甲醇洗脫不下的非極性雜質。實驗中采用乙腈提取后加入無水硫酸鈉，乙腈濃縮后，在樣品定容時采用正己烷脫脂凈化，結合質譜儀器的在線凈化，實現樣品快速分析。乙腈提取后再加入無水硫酸鈉是為了防止無水硫酸鈉結塊，溶劑不能充分滲透而導致回收率偏低。在樣品定容時加入正己烷可以很好的去掉非極性的脂肪等雜質。質譜儀器上的在線切換閥將5.5分鐘前所流出的雜質切換至廢液中，可以有效的消除鹽和低保留雜質對質譜離子源的污染。樣品的加標圖和標準圖相比，幾乎沒有干擾，與前處理過程中通過HLB固相萃取凈化的效果幾乎一致。