溶菌酶能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，其水解位點是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子間的β-1.4糖苷鍵。
肽聚糖是細菌細胞壁的主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4個氨基酸)組成，NAM與NAG通過β-1.4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過D-乳酰羧基連在NAM的第3位碳原子上，肽尾之間通過肽“橋”(肽鍵或少數幾個氨基酸)連接，NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網狀結構，作為細胞壁的骨架，上述結構中的任何化學鍵斷裂，皆能導致細菌細胞壁的損傷。
對于革蘭氏陽性菌（G+），如藤黃微球菌、枯草桿菌或溶壁微球菌等，與革蘭氏陰性菌(G-)，如大腸桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌等，其細胞壁中肽聚糖含量不同，G+細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而G-細菌只有內壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶對于破壞G+細菌的細胞壁較G-細菌強。