焦磷酸測序原理

　　焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是一種新型的酶聯級聯測序技術，焦磷酸測序法適于對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性(single nucle—otidepotymorphisms，SNPs)研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平臺。

　　該技術進行改進后可以滿足上百個核苷酸序列的測序工作，這樣該技術又可以滿足對重要微生物的鑒定與分型，特定DNA片段的突變檢測和克隆鑒定等方面的應用。原理焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。

焦磷酸測序技術的原理是：引物與模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術的反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構成。反應底物為5’-磷酰硫酸(adenosine -5’-phosphosulfat，APS)、熒光素(1uciferin)。反應過程在每一輪測序反應中，反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP,在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上述反應不會發生，也就沒有檢測峰。反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發生降解。待上一輪反應完成后，加入另一種dNTP，使上述反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。

應用焦磷酸測序技術可以用來研究單核苷酸多態性(single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遺傳多態性，植物多態性分析，分子診斷細菌與病毒分型、甲基化分析、法醫鑒定及藥物基因組學等方面都有廣泛的應用。該技術不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。

與Sanger測序法相比，焦磷酸測序技術有其特定的優勢，已經成為DNA分析研究的重要手段。目前已經有很多關于該技術在分子生物學上的應用研究，而且隨著技術的不斷成熟和改進，在實踐中的應用將越來越廣泛。Jonasson等運用焦磷酸測序技術通過檢測病原菌16S rRNA基因，快速鑒定臨床標本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸測序技術檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因(16S rDNA)易變的Vl和V3區序列，證明該技術可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型;Unnerstad等利用該技術對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，在短時間內完成大量的樣本測序，其并行性和高效率非常顯著，如果用常規的測序技術，工作量會很大。Gharizadeh等人用此技術對67個人乳頭瘤病毒(HPV)樣品進行了鑒定和分型，結果證明該技術也非常適于HPV等病原體的大規模鑒定、分型和突變的研究。瑞典Uppsala大學利用焦磷酸測序技術建立了新的鑒定炭疽熱細菌(Bacillus anlhracis)及其致病狀態的方法，他們利用此技術分析染色體上的Ba813基因(此基因長度為277bp，在染色體上為單拷貝是炭疽熱桿菌區別于其他土壤桿菌的標志)20bp的特異序列來鑒定炭疽熱細菌.準確率達99.6 %，通過分析菌株是否含有兩個質粒(鑒定pX0l的lef基因和pX02的cap基因)來確定炭疽熱細菌的致病狀態.準確率達100‰。Edvinsson B等應用焦磷酸測序技術對T弓形體蟲的三個亞型進行區分，采用Real-Time PCR技術擴增出目的片段，在此基礎上運用焦磷酸測序技術測定GRA6基因中兩個單核甘酸多態性確定其分型,該技術對典型蟲株的準確率達到100%,對包括非典型性蟲株的分型準確率也達到81%。

該技術還被應用于百日咳桿菌(Bordetella pertussis)與副百日咳桿菌(Parapertussis) 等細菌的快速鑒定及分型。在國內，該技術應用受到越來越多研究者的重視。趙錦榮等，首先運用PCR擴增含耐藥決定區一297bp長的rpoB基因片段，借用鏈親和素包被磁珠純化單鏈PCR產物，設計2個正向測序引物，運用pyrosequencing技術對耐藥決定區進行序列測定.通過對一系列10倍稀釋的結核分枝桿菌H，R標準株DNA進行分析，評價所建立方法的檢測特異性.結果：PCR擴增后，可在2 h內得到耐藥決定區序列.所建立方法的檢測靈敏度為50 fg DNA/反應.在所分析的利福平敏感株中均未檢測到耐藥決定區突變，而在耐利福平菌株中均檢測到耐藥決定區突變.所建立的方法具有自動化程度高和結果準確等特點，適用于對耐利福平結核分枝桿菌進行快速高通量檢測。程紹輝等，從感染人sars病毒的Vero-6細胞中提取病毒RNA，反轉錄為cDNA后，PCR擴增目的基因片段，采用焦磷酸測序技術(Pyro -sequencing Technology，PSQ)進行第2601、7919、9479、119838多個堿基突變位點測序和突變頻率分析。

通過測序分析多個可能出現突變的位點，確定了該病毒為北京流行株，同時發現第7919位堿基發生了A/G突變。宋家武等應用該技術建立了高通量測定乙型肝炎病毒YMDD突變區的方法，經標準的YMDD突變質粒及血清標本的重復性及可靠性檢測，質粒標準品的突變檢出率及重復率均達100%，而血清標本達98.8%。另外，在法醫鑒定，以及SNP分析上都有應用該技術的研究報道，并且可以起到快速，準確的效果。在動物如豬的多態性分析研究中，Milan等利用焦磷酸測序技術發現豬骨骼肌糖原含量增高與PRKAG3基因的一個不可逆轉的堿基置換相關，該基因編碼豬肌肉特異性的腺苷單磷酸激活的蛋白激酶異構體的調節亞單位。

優點：

1. 不需要制膠，不需要毛細管，也不需要熒光染料和同位素。

2.10分鐘內可分析96個樣品的SNP,可滿足高通量分析的要求。

3.每個樣品孔都可進行獨立的測序或SNP分析，實驗設計靈活。

4.序列分析簡單，結果準確可靠。

發展

目前市場上焦磷酸測序儀的測序原理主要有四種，即使用合成法測序（Sequencing by Synthesis）的 454 和Solexa，以及使用連接法測序（Sequencing by Ligation）的SOLiD和Polonator。以454焦磷酸測序技術為例，該技術無需文庫構建，沒有克隆誤差，目前已應用到土壤、海洋、廢水等環境生態學的研究中。而454焦磷酸測序與傳統測序技術相比，具有以下優勢：

（1）高通量性：每一次循環反應，可產生得到大于1Gb的數據，讀取10億個堿基；

（2）效率高：每一次循環反應僅需3天；

（3）精讀范圍大：可精讀18bp個以上的重復序列；

（4）方向多元：可進行400bp長度的末段雙向測序。

通過對環境樣品進行宏基因組提取，對其16S rDNA擴增后，采用454焦磷酸測序技術對宏基因組樣品進行測序分析，可以清楚的得到環境樣品的微生物信息。