六、中期染色體標本的變性
1.在染色缸中加入大約50mL變性液，將染色缸放于75?76℃水浴中。預熱變性液使其溫度達到（73±2)℃。
2.從-20℃冰箱中取出實驗所需的標本，室溫下系列乙醇脫水，各2min。
3.室溫干燥片子（5min)，或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本干燥。
4.在37?40℃電熱板上預熱片子30s。
5.將標本浸入（73±1)℃的變性液中變性2.5?5min。
6.迅速取出標本，放入冰冷的70%乙醇中3min，然后在85%和100%乙醇中脫水各3min。
7.晾干標本玻片（5min)，或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本干燥。
七、探針變性
在中期染色體標本片系列乙醇脫水的同時，將裝有CGH探針的離心管在(75±1)℃水浴中變性10min。
八、雜交
1.將注射器針筒（已將枕頭去掉）中吸入橡皮泥。
2.將標本片在37?40℃電熱板上預熱片子約1min。
3.標本片在電熱板上，將每個CGH探針加到標本的同一個雜交區域上，每個雜交區域蓋上22mm×22mm玻璃蓋玻片。
4.用注射器擠壓橡皮泥，沿著蓋片邊緣進行封片。
5.37℃濕盒中孵育標本2?3d。
九、雜交后洗脫
1.在染色缸中加入大約50mL的2×SSC溶液，預熱使其溫度達到72℃左右（水浴鍋溫度設置在大約75℃)。
2.在染色缸中加入大約50mL的4×SSC溶液，預熱使其溫度達到37℃左右（水浴鍋溫度設置在大約39℃)。
3.在染色缸中加入大約50mL的4×SSC/0.1%Triton×-10O溶液，預熱使其溫度達到37℃左右（水浴鍋溫度設置在大約39℃)。
4.在染色缸中加入大約50mL的2×SSC溶液，室溫放置。
5.在染色缸中加人大約50mL的蒸餾水，室溫放置。
6.從標本片上除去橡皮泥。
7.輕輕滑掉蓋片（不要劃傷標本)。
8.將標本片置于（72±2)℃的2×SSC溶液中，晃動標本片2min，然后在該溶液中停留5min。
9.將標本片轉移到37℃的4×SSC溶液中放置5min。
10.將標本片轉移到37℃的4×SSC/0.1%TritonX-100溶液中放置5min。
11.將標本片轉移到37℃的4×SSC溶液中放置5min(可使用與步驟9中的同一溶液)。
12.將標本片轉移到室溫下的2×SSC溶液中停留5min。
13.將標本片轉移到室溫下的水中停留5min。
14.標本片自水中取出，置于暗處室溫晾干；或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本快速干燥。
15.在標本片的靶區域上加10μL DAPI復染劑。
16.蓋上蓋玻片。
17.將標本片置于暗處5?10min，然后進行CGH圖像抓取和分析。
18.拍攝至少常染色體各10個，性染色體各7個。
收起
注意事項
1.一般選擇正常男性對照，這樣使得一張中期染色體標本片中同時有X染色體和Y染色體。
2.如果初步細胞遺傳學分析已在其他實驗室完成，患者的血樣應放入有肝素鈉的管中，可隨后進行提取DNA或需要的話進行外周血培養用于FISH實驗。在這種情況下，采血量最好超過3mL。如果患者是嬰兒，采血量通常小于3mL，只要血量足夠進行DNA提取即可。
3.可以提取大量男性和女性參考DNA，儲存在-20℃備用。
4.每批新的DNA酶要進行0.0?0.1U/mL的濃度梯度實驗，通過瓊脂糖凝膠電泳以確定哪種濃度能得到最理想大小的DNA片段，一般用該濃度的DNA酶進行標記效果理想。
5.—次標記超過1μgDNA可得到大量的標記參考DNA，可歸存在-20℃。
6.應制備一張標本片進行預試驗以確定有絲分裂指數，評估是否需要用固定液稀釋細胞懸液，或離心后用較少體積的固定液重懸細胞。
7.—張載片上滴兩個區域，可以在一張片子上同時進行兩個不同的CGH實驗，但是應確保兩個區域的染色體都分散良好。
8.進行中期染色體標本片的制備，其目標是：①得到的中期染色體分散均勻、相當染色體臂比較直、染色體之間重疊較少；②載玻片和染色體上殘留的細胞質盡可能少；③相差顯微鏡下觀察中期染色體呈現灰色[不太黑和（或）太亮，也不太淺或太朦朧]。
9.中期染色體標本片的質量是CGH過程中最關鍵的因素。每批標本片都應進行預實驗，質量比較好的標本片儲存在-20℃。在滴制片后約兩周進行預實驗，一旦結果滿意，在-20℃儲存這批標本片。一般整批標本片的質量相似，如果一批標本片沒有得到滿意的結果，這批標本片可以用于其他實驗如FISH，或扔掉。在精通中期染色體標本制備的實驗室中，應該首選他們常用的中期染色體制備方法。許多情況下，能滿足注釋8中標準的中期染色體同樣適合CGH分析。
10.制備CGH探針時，應考慮制備兩種不同的探針，一種是與患者性別相同的參考探針，另一種是性別不同的參考探針。性別相同的探針在揭示染色體(包括性染色體）的不平衡性染色體異常時非常重要。如果一張片子的兩個雜交區域采用兩種探針（見注釋7)，性別不同的參考探針可以作為內對照，因為預期整條性染色體顏色比率不同。
11.標記病例（marker case)中采用約20μgCot1-DNA，而所有其他病例中采用約30μgCot1-DNA。絕大多數的標記染色體含有著絲粒，對于某些病例采用較少的Cot1-DNA提高檢測效能。
12.變性液應預熱至少30min。溶液可在微波爐中用最高檔20s以加速預熱過程。
13.確定每批標本片的最適變性時間。合適的標本在較大范圍的變性時間內都可得到好的雜交結果和DAH反轉帶型。最初變性時間可以嘗試3.5?4min。